高表达野生型或激活突变shp-2酪氨酸磷酸酶对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制的探讨-effects of overexpression of wild-type or activated mutant shp - 2 tyrosine phosphatase on malignant biological behaviors of breast cancer cells and its mechanism.docxVIP

PAGE PAGE 10 Abbreviations TBS Tris buffered saline SDS SDS polyacrylamide gel electrophoresis ddH2O di-distilled water ECL enhanced chemiluminescence cDNA complementary DNA EB e thidium bromide DEPC diethyl pyrocarbonate FN Fibronectin PCR Polymerase chain reaction BSA bovine serum albumin EDTA ethylenediaminetetraacetic acid SDS sodium dodecyl sulphate PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride EGF epidermal growth factor OD optical density DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium FBS fetal bovine serum PBS phosphate-buffered saline Erk extracellular signal-regulated kinase PI3K phosphatidylinositol-3 phosphate kinase 高表达野生型或激活突变 SHP-2 酪氨酸磷酸酶对 乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制的探讨 【研究背景】 中文摘要 乳腺肿瘤是临床上的常见病和多发病，其发病率和死亡率逐年呈上升趋势， 近年来已跃居女性恶性肿瘤第一位。造成乳腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤的 转移和复发，迄今没有满意的治疗方法。近年来越来越多的研究表明，SHP-2 的激活突变或过度表达可能与乳腺肿瘤的发生和转移密切相关。但其在乳腺癌 的发生发展、演化和转移中的作用机制尚未明确。 SHP-2 属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，是一个在哺乳动物的组织细胞 广泛存在的致癌基因。SHP-2 和其它的蛋白酪氨酸磷酸酶一起共同调节细胞的 许多重要过程，并且导致了肿瘤的发生。 研究表明 SHP-2 在多种信号转导途径 中都起着重要的作用，尤其是在造血细胞的生成及分化中起着十分重要的作用； 相对于正常的造血干细胞而言，SHP-2 在白血病细胞珠以及成人白血病样本中的 表达量都是显著升高的。近年来的研究也证实，在大约 50%的努南综合征，髓 系白血病，儿童型粒单细胞性白血病及多种实体瘤中发现了体细胞 PTPN11 基因 的错义突变位点；在几乎所有的乳腺癌细胞株中 SHP-2 均是呈高水平表达的； 此外，在乳腺癌伴淋巴结转移的组织中检测到 SHP-2 表达也是上调的，因此推 测 SHP-2 可能在乳腺癌的发生发展过程中起到了至关重要的作用。然而目前, 有 关 SHP-2 与乳腺癌相关性研究很少有报道。 【研究方法】 为探讨 SHP-2 激活突变或过表达对乳腺癌 MDA-MB231 细胞生物学表型的 影响，本研究成功构建了 SHP-2 真核表达载体，转染乳腺癌 MDA-MB-231 细胞， 筛选并鉴定了稳定表达 SHP-2 的 MDA-MB231 细胞；检测 SHP-2 激活突变或过 表达对 MDA-MB231 细胞生长、克隆形成能力、凋亡和侵袭的影响；分析 SHP-2 对乳腺癌细胞恶性生物学行为影响的可能作用机制。实验结果如下。 【研究结果】 （1）成功构建了 SHP-2 野生型及突变型真核表达载体，并经酶切和测序鉴定证 实插入序列与设计的完全一致。将其转染进 NIH3T3、MDA-MB231 细胞，稳定 克隆的筛选和鉴定：经 Western blot 筛选出稳定表达 SHP-2 的 NIH3T3、 MDA-MB231 单克隆，分别命名为 pcDNA3.1 、 pcDNA3.1SHP-2-WT 及 pcDNA3.1SHP-2D61G/+乳腺癌及 NIH3T3 细胞。 （2）SHP-2 激活突变或野生型过表达对乳腺癌细胞生长的影响： MTS 结果显 示，对照组和空载组细胞增殖速度接近，而突变组和过表达组增殖率明显增加， 平板克隆和软琼脂克隆形成实验结果表明突变组及过表达组细胞克隆的形成多 于对照组细胞。说明转染 SHP-2 后增加了细胞的二维和三维克隆形成能力。 （3）SHP-2 激活突变或野生型过表达对乳腺癌细胞粘附和凋亡的影响：粘附实 验检测结果显示，突变组或过表达组乳腺癌细胞粘附率高于对照组和空载体组。 Annexin-V/PE 单染试剂盒检测细胞凋亡结果发现，与对照组和空载体组相比， 突变组或过表达组凋亡细胞数均明显减少，说明转染 SHP-2