目的基因导入受体细胞知识介绍.ppt

第五章 目的基因导入受体细胞;5.1 受体细胞;;;原核生物细胞;二、枯草杆菌受体细胞 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。;三、蓝细菌（蓝藻） 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在： 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。 细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。;真核生物细胞;;三、动物受体细胞： 优点： 能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。 易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。 缺点：组织培养技术要求高，难度较大。 目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点。 ;5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。 转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。 ;;;以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：;;;;⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子。;;（1） Ca2+诱导的大肠杆菌转化法;;;;DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制 ;;（2）电穿孔转化法;;（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌;;;;（4）转化率的计算及其影响因素 ;;影响转化率的因素;;;5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 ;;;λ噬菌体DNA体外包装的主要过程;;5.2.3 受体细胞的选择 ;①限制与修饰系统;②重组系统 ;③易于转化或转导;④有明显的选择性差异;⑤感染寄生缺陷型;5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 ;;选择合适的转化外植体;农杆菌接种操作 ;;;;; (2)DNA的直接转移 ;①多聚物介导法;;②电穿孔转化法;③激光微束穿孔转化法;④显微注射法;⑤超声波介导转化法;⑥基因枪法;⑦脂质体介导法;⑧花粉管通道法;5.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 ;病毒种类多样及病毒DNA或RNA构建的载体性质的各异，所以转导的过程各不相同，主要有三种类型： 一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒。 二，带有目的基因的毒病是缺陷性的，须同另一辅助病毒一起感染受体细胞．在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。 三，虽然带目的基因的SV40病毒是早期转录缺陷型的，但被感染的COS细胞系的基因组中整合有SV40早期转录区段DNA，所以没有必要用辅助病毒作混合感染。 ;②磷酸钙转染法;③DEAE-葡聚糖转染法;④聚阳离子-DMSO转染法;⑤显微注射转基因技术;⑥电穿孔DNA转移技术;⑦脂质体介导法;5.3 重组子的筛选;将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫