基因工程重组体克隆筛选和鉴定.pptVIP

2. 过程 第63页/共89页 四、杂交释放转译法 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。 第64页/共89页 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA编 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 第65页/共89页 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 第66页/共89页 一般克隆与筛选策略 第67页/共89页 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR 第68页/共89页 ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 第69页/共89页 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成dTTP，存活。 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。 dUMP dATP dTTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 第70页/共89页 ① HAT培养基： Tk- 细胞株。 TK基因。 ② 宿主细胞 ③ 载体标记 （2）TK选择过程 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） 只有转入TK基因的细胞才能生存。 第71页/共89页 第72页/共89页 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 第73页/共89页 DHFR+细胞 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ 第74页/共89页 DHFR- 细胞 DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 需要补救！ 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。 第75页/共89页 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 dUMP dATP TTP dATP 次黄嘌呤 补救 胸苷 补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时， 胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救: 第76页/共89页 DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 ① 宿主细胞 （2）选择过程 透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。 ② 无核苷酸的培养基 需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ 第77页/共89页 ③ 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。 DHFR+基因。 ④ 载体标记 只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。 DHFR- DHFR- DHFR+ DHFR+ live die 无核苷酸的培养基 第78页/共89页 是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）选择原理 ① 新霉素（neomycin） 新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。 ② G418（geneticin） 第79页/共89页 ③ 新霉素抗性基因--neor 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 第80页/共89页 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可。 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标记 （2）选择过程 G418：（100-800?g/mL）