三用于基因克隆载体.pptxVIP

3.1 载体的功能及特征;3.1.2 载体应具备的条件;3.2 质粒载体;;3.2.2.1 共价闭合环状DNA（cccDNA);3.2.2.3 线形DNA （ linear ，L-DNA）;同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：;3.2.3 质粒的自主复制性;任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群;质粒的不相容性：分子机制;3.2.5 质粒的可转移性;大肠杆菌接合（conjunction）;3.2.6 携带特殊的遗传标记;3.2.7 质粒的构建;;（2）筛选标记不理想;3.2.7.2 理想载体条件;3.2.7.2质粒的选择标记及其工作原理：;i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。;ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）;a）杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。 ;iv）链霉素（Streptomycin，Str）;v）四环素（Tetracycline，Tet）;3.2.7 质粒的分类;3.2.8 重要的大肠杆菌质粒载体;pBR322 由F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建;;;① 双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两次先后选择： ;外源基因?BamH I;② 分子小，克隆能力大：载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。;pBR322 4363;;3.2.8.2 pUC18 / 19： ;;;pUC18/19;pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理;1）?-肽（ lacZ’ ）：;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;IPTG诱导的结果：;;① 更小的分子量：;3.2.8.3. pGEM-3Z;① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA;3.2.8.4. PMD18-T;3.2.8.5. PMD18-T;3.3 噬菌体或病毒DNA;3.3.1 噬菌体的生物学特性： 生物结构;l 噬菌体生物学特性： 生物结构;l 噬菌体生物学特性：溶菌周期;l 噬菌体生物学特性：溶菌周期;;l 噬菌体生物学特性： 溶原状态;;?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。;（2）滚环复制 ;;（1）构建原理：;（3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型：;;2）?-半乳糖苷酶失活型载体：;② 替换型载体（substitution vectors);1）? EMBL4;2）Charon40;可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。;? DNA象质粒载体那样直接转化??菌时效率远比质粒低。; ; 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。;E基因突变;外源的重组?DNA载体被诱发与内源性原?DNA发生重组。;③ 体外包装的容量限制：;3.3.5 l-DNA作为载体的优点：;3.4 单链噬菌体载体;3.4.1 M13噬菌体的生物学特性： 生物结构;3.4.2 M13的生活周期;;3.4.3. M13载体的构建：;M13 DNA载体的构建：;;在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。;;3.4.4 M13 DNA载体的特点：;3.5 考斯质粒与噬菌粒;3.5.1 考斯质粒（cosmid）;考斯质粒载体的特点：;3.5.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）;重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119;重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体;3.6 人造染色体载体;A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。;（1）DNA复制起始点（ori） ;（1）着丝粒区（CEN）;酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。;位于 SUP4 基因内部。;TRP1、URA3（分别位于两臂）。;YAC载体应含有下列元件： ;酵母人造染色体的使用：;H. Shizuya等在大肠杆菌F因子基础上构建的。;3.6.2 BAC的组成结构;;3.6 表达载体;载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。;pKK223-3 ： 4584bp，使用的启动子：tac 强启动子，杂合启动子 trp-lac ；终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读）。