蛋白质分离纯化2.pptxVIP

第一节 蛋白质的理化性质;第一节 蛋白质的理化性质;一、蛋白质的酸碱性质;二、蛋白质的紫外吸收性质;三、蛋白质的胶体性质和沉淀;（二）蛋白质的沉淀;　盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(如：硫酸铵,硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。;2.　有机溶剂沉淀法;3.　重金属盐沉淀法;4.　生物碱试剂和某些酸类沉淀法;5.　加热变性沉淀法;四、蛋白质的变性和复性;五、蛋白质的呈色反应;第二节 　蛋白质的分离纯化; 一、蛋白质分离纯化的一般步骤;二、蛋白质的分离纯化方法;（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法;1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）;透析流程;超过滤装置;;3：凝胶过滤法;（1）凝胶过滤的介质;凝胶过滤分离蛋白质的流程;这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。;（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法 （蛋白质的胶体和沉淀性质）;1.等电点沉淀和PH值控制;2.蛋白质的盐溶和盐析;3.有机溶剂分级分离法;4.改变温度分离蛋白质;（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法;电泳概述;1.聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS);;点样;;2.毛细管电泳;3.等电聚焦电泳; 实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。;4.蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis）; 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。;是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。; 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。;以阳离子交换型树脂为例;结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： ; 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。; 亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力, 即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方???。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。;亲和层析;样品;;;;蛋白质的分离纯化方法;第三节 蛋白质分子量的测定(P291-299);一、根据化学组成测定最低相对分子质量;例如:某种蛋白含铁量为0.335%, 其最低相对分子质量(假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白)可按下式计算出: ;渗透现象：溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向的净移动现象。;;（三）蛋白质的扩散和扩散系数;（四）沉降分析法测定相对分子质量;1. 沉降速度法测定相对分子质量;如人血红蛋白沉降系数s=4.46S，即4.46×10－13秒。 为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的s值。沉降系数的标准条件定为20?C,溶剂为水。校正后的沉降系数用s20，w表示。;;2. 沉降平衡法测定相对分子质量;;　利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来;如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积（elution volume）,则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径,称蛋白质分子的斯托克半径。 因此,标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的Mr。;Gel filtration column;1966年Andrews提出了一个经验公式 ;(六) SDS －PAGE法测定相对分子质量 ;在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶分子筛效应,电泳迁移率与蛋白质分子量的对数有下列关系： ;;第四节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定;一、 蛋白质含量测定;; 蛋白质等电点 等离子点 盐析 盐溶 蛋白质的变性 复性 茚三酮反应 双缩脲反应 层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 透析 电泳 SDS等电聚焦 双向电泳 渗透现象 扩散 扩散系数 蛋白质的沉降 沉降系数 蛋白质的斯托克半径;知识点