基因工程基因文库构建.pptxVIP

1、基因文库(gene library)概念 是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。;2、基因文库的分类;;(1)基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。 目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 基因组文库根据DNA来源分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库、线粒体基因组文库。 克隆外源 DNA片段的切割主要采用机械断裂或限制性部分酶解两种方法，其基本原则： ①DNA 片段之间存在部分重叠序列。 ②DNA 片段大小均一。;(2) cDNA文库 (cDNA library) ： 是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 基因组文库与cDNA文库的最大区别： 基因组文库含有而cDNA文库不含有非转录的基因组序列。;3、构建基因文库的基本方法 将特定生物体的因组DNA或cDNA分解成适当大小的DNA片段,然后分别与克隆载体连接成重组DNA分子。 通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。;二、基因组文库的构建;(二)基因文库的完备性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：;（三）基因组DNA文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNA 文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分 隔克隆。 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以 利于克隆排序。 克隆片段易于从载体分子上完整卸下。 ???组克隆能稳定保存、扩增、筛选。;(四)基因组文库构建的一般步骤 ① 载体的选择和制备。 ② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取。 ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离。 ④ 载体与DNA片段的连接。 ⑤ 转化或侵染宿主细胞。 ⑥筛选鉴定基因组及保存。 ;①载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或l-DNA 上述几种载体的最大装载量如下：;②基因组DNA的制备 为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3－5倍），文库的重组率和完备性也就越高。 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 100 kb大小的DNA片段。;③基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： ①保证DNA片段之间存在部分重叠区。 ②保证DNA片段大小均一。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。 部分酶切法一般选用4碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！！！;④载体与DNA片段的连接 在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！ 方法一：粘末端连接 方法二：人工接头法 ⑤转化或侵染宿主细胞 在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的。 进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！;（五）基因组文库构建的技术性问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离。 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团。 在DNA片段的末端添加人工接头 。;（六）构建基因组文库应注意的问题 构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功