rna干扰永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子对pi3kaktmtor信号通路相 关因子的影响-effect of rna interference on nuclear stem cell factor in immortalized esophageal epithelial malignant cells on pi 3 kakmtor signal pathway related factors.docxVIP
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rna干扰永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子对pi3kaktmtor信号通路相 关因子的影响-effect of rna interference on nuclear stem cell factor in immortalized esophageal epithelial malignant cells on pi 3 kakmtor signal pathway related factors
所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年月日摘要目的检测人永生化食管上皮细胞(ShantouHumanEmbryonicEsophagealEpithelialcellline,SHEE)及其恶变细胞(ShantouHumanEmbryonicEsophagealCarcinomaEpithelialcellline,SHEEC)中核干细胞因子(Nucleostemin,NS)和磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphninositide3-kinase/proteinkinaseB/mammaliantargetofrapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信号转导通路中关键因子PI3K、AKT、mTOR的表达水平。然后利用RNA干扰(RNAi)技术沉默癌细胞SHEEC中NS基因的表达,探讨NS基因下调后对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中相关分子表达的影响,检测抑制NS基因后对SHEEC细胞凋亡和增殖的影响,初步探索NS基因在食管癌发生发展过程中的作用及其对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的影响。方法1.SHEE和SHEEC细胞连续传代培养,取对数生长期细胞,分别提取RNA和蛋白,然后采用Real-timePCR和WesternBlot方法检测SHEE及SHEEC细胞中NS基因和PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中关键因子PI3K、AKT、mTORmRNA和蛋白的表达水平。2.利用RNAi技术沉默SHEEC细胞中NS基因的表达,用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染6h后的转染效率,RT-PCR检测转染24h后NS基因的表达水平并计算其抑制率。3.转染24h和48h以后,分别用RT-PCR和WesternBlot方法检测SHEEC细胞中NS表达下调后PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键因子mRNA和蛋白水平的表达变化。4.流式细胞仪和MTT方法分别检测干扰NS基因前后SHEEC细胞凋亡率和增殖活性的变化。5.采用SPSS21.0统计软件中的t检验和方差分析对实验结果进行分析,数据用X±S表示,检验水准为α=0.05。结果1.癌细胞SHEEC中NS、PI3K、AKT、mTOR和GβLmRNA的表达量均显著高于正常细胞SHEE,分别为SHEE细胞的2.047±0.507、2.13±0.262、1.614±0.256、2.072±0.746和2.00±0.432倍,差异有统计学意义(P0.05);NS、PI3K和p-AKT蛋白在SHEEC细胞中的表达也显著高于SHEE细胞,差异有统计学意义(P0.05)。2.转染细胞6h后,荧光显微镜下观察到NS-RNAi成功转染至SHEEC细胞中,流式细胞仪检测转染效率为87.18%,RT-PCR检测NS基因在SHEEC细胞中的表达水平明显下调,NS的抑制率约为47.8%。3.RT-PCR结果显示,抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后PI3K、AKT、mTOR和GβLmRNA的表达均明显下降,NS-RNAi组与SHEEC组、NC组和IIMOCK组比较差异均有统计学意义(P0.05);WesternBlot结果显示,抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后PI3K和p-AKT基因的蛋白表达量为0.353±0.361和0.312±0068,与SHEEC组、NC组和MOCK组比较差异具有统计学意义(P0.05)。4.NS-RNAi组细胞凋亡率显著高于SHEEC组、Mock组和NC组(35.487±1.631vs.0.227±0.114、6.683±0.486、11.580±2.24,P0.05);NS-RNAi组与SHEEC组、Mock组、NC组和GAPDH组比较,细胞增殖能力显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论1.NS和PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中关键因子在SHEEC细胞中高表达,在SHEE细胞中低表达。2.抑制SHEEC细胞中NS基因的表达后NS与PI3K/AKT/mTOR信
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