rna适体与代谢小分子相互作用的分析-analysis of interaction between rna aptamers and metabolic small molecules.docxVIP

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2018-06-01 发布于上海
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rna适体与代谢小分子相互作用的分析-analysis of interaction between rna aptamers and metabolic small molecules.docx

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rna适体与代谢小分子相互作用的分析-analysis of interaction between rna aptamers and metabolic small molecules

以不完全配对方式结合来发挥调控作用，那么sRNA是否具有适体结合代谢小分子的功能呢？通过比较我们选取了与糖代谢相关的SgrS进行验证，SgrS是葡萄糖压力相关的sRNA，当葡萄糖压力增大时，SgrS能阻止葡萄糖分子的跨膜运输。我们首先构建了SgrS过表达体系，检测在有或无葡萄糖刺激的情况下，其靶基因ptsG的表达水平是否发生变化。实验结果证明，SgrS对其靶基因ptsG表达水平的影响不依赖于葡萄糖。综上所述，我们利用SELEX筛选技术获得了能够和精氨酸特异性结合的RNA适体，构建了其在大肠杆菌体内的过表达体系，初步评价了其在大肠肝菌内的生物功能，并且验证了细菌sRNA——SgrS是否具有结合代谢小分子的功能。本论文通过探索RNA适体与代谢小分子的相互作用，为原核生物非编码小RNA调控基因表达提供了新思路。关键词：RNA适体；指数富集配体系统进化技术；sRNA；代谢小分子TheStudyonInteractionsbetweenRNAAptamerandSmallMetabolicMoleculeAbstractNucleicacidaptamersareselectedfromsinglestrandpoolsofrandom-sequenceoligonucleotidesthroughSELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment).NucleicacidaptamersaredividedintoDNAaptamerandRNAaptamer.RNAaptamerspossessvarioussecondarystructures,whichleadtohighaf?nityandspeci?cityfortheirwiderangeoftargets.Besides,theyareeasytobesynthesizedandmodified.Owingtotheadvantageslistedbefore,RNAaptamersarethemostpromisingaptamersinbasicresearch,clinicaldiagnosisandtherapeutics.Inthisarticle,anarginine-bindingRNAaptamerisobtainedthroughSELEXanditsbiologicalactivityisevaluated.Wesynthesizea100nucleotidesrandomsinglestrandDNAlibrary,whichiscomposedof37fixednucleotidesinbothendsand63randomnucleotidesinthemiddle.TherandomRNAlibraryisbuiltthroughPCRandinvitrotranscriptionoftheDNApool,whichdemonstrateswell-proportionedbasesandallthepossibilitiesofrandomassortments.ArgininecovalentwithagarosebeadisusedastargettoselectRNAaptamersinourexperiment.Whenwegetthesecondarypoolafteronecycleofbingdingexperiment,thebingdingprocessisrepeatedthroughreversetranscription,PCRandtranscriptionagainuntiltheproductsareprovedwithhighaffinity.WeovercomethedifficultiesofPCRthroughregulatetheamplificationcyclesandlowtranscriptionefficiencythroughaddingregulationsequence.Finally,RNAsequence（named22-7）isobtainedthrough22cyclesofinvitroselection,whichoccurs6timesinthe100clonesofthe22ndcycle,aswellas5timesinthe100clonesofthe20thcycle.Then,weuseITCtodetecttheaffinitybetween22-7andfreearginine.Inordertostudytheinternalfunctionof22-7,wecomparethesimilar