流式细胞术的发展史58页.pptVIP

流式细胞术的发展史 1934年细胞在显微镜载物台的毛细管中流过。 1949年流动的悬浮粒子计数方法—Coulter效应。 1967年发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪。 80年代出现了完善的流式细胞仪。 概 述 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种自动分析细胞的高技术，其原理是悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过测量区，当每一个细胞通过测量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光、光散射，光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速地、大量地测定。 上述特性可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个细胞群体中分选出来。 流式细胞术在当前的细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、遗传学、病理学、临床检验学等各领域有着十分广泛的用途。 流式细胞术是对悬液中的细胞或细胞器进行快速可达每秒钟数千个乃至上万个细胞。这样，它就可与显微镜相互补充。显微镜术可以研究组织的结构、细胞定位和荧光在细胞中的分布；而多数流式细胞术是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的总核酸，总蛋白等而不能测量细胞中某一特定部位的核酸或蛋白，这是它的不足之处。 由于现代荧光技术和多参数相关测量技术的发展，流式细胞术在细胞群体或组成群体的亚群进行定量分析时，又具有其他手段无法比拟的优越性。 用飞点扫描技术或缝隙扫描技术得到了细胞形态学方面低分辨率的信息，从而改变了流式细胞仪零分辨率的传统观点。 流式细胞仪的结构 FCM是由细胞流动室、光源、聚光装置、信号检测器、电子计算机及高级别仪器具有的细胞分选装置构成。 细胞流动室 细胞流动室是FCM的心脏，它是根据流体力学中的层流鞘液原理设计而成，其结构包括石英小室形成的鞘液腔及插入其中的样品管。细胞呈单个排列通过流动室。 光源 常用激光器： 氢离子激光器 488nm兰色激光 氩离子激光器 氪离子激光器 聚光系统和检测系统 透镜、小孔、多种滤片 检测器、放大器将光信号变成电脉冲信号 计算机 信号变成数据文件存储、分析。 流式细胞仪的工作原理 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。 流式细胞仪的工作原理 通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统（透镜、光阑、滤片和检测器等）用以收集荧光信号。图中的阻断滤片用于阻挡激发光，二色性反射镜用于选择被测荧光波长，荧光检测器是光电倍增管（PMT），散射光检测器是光电二极管，用来收集前向角散射光（FSC）。 细胞分选（cell sorting）的工作原理 液滴形成信号的频率约30KHz，此信号加在压电晶体上使之产生同频的机械振动，流动室也就随之振动。于是液柱断裂成一连串均匀的液滴，其形成的速度为每秒3万个。细胞通过喷嘴的速度大约每秒2000个以下，如以2000个计算则平均每15个液滴中有一个液滴包有细胞，而其他液滴无细胞。细胞的性质是在进入液滴以前已经被测定了的。 细胞分选（cell sorting）的工作原理 如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷。这样，当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细胞形成的细胞液滴及不包含细胞的空白液滴不被充电，也不带电荷。带有电荷的液滴向下落入指定的收集器内，从而完成了细胞分类收集的目的。 散射光的测量 在流式细胞术中，从光的散射信号可以得到非常有价值的信息。因为细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性，所以可以用散射光的信号对未染色的活细胞进行分析和分选。 细胞在液流中通过测量区时，经激光照射，细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小、形状，质膜和细胞内部的折射率有关。经过固定和染色的细胞，因折射率有了变化，故其散射状况与未固定或未染色的不同。 散射光与细胞参量间的关系与散射角、照射光束的形状、收集散射光立体角的大小等都有关。在流式细胞术中常被利用的有前向角散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者亦称0°散射，后者亦称90°散射。 荧光测量 荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受激后发射的。荧光波长与激发光波长不同且强度较弱，为此就要使用滤片以滤除非荧光信号并使用灵敏的探测器。下面我们将分别进行讨论。 荧光测量 激光与普通光线不同