转基因动物 生命科学前沿 教程文件.pptVIP

转基因动物; 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合人工导入外源基因的动物称为转基因动物（transgenetic animal）。;外源目的基因的制备 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携有目的基因的细胞 选择合适的宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系;第一节 目的基因的制备;;磷酸钙—DNA共沉淀法;脂质载体包埋法;逆转录病毒介导法;显微注射转基因技术;何为显微注射？ 显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。;;;通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图;（一）显微注射DNA的制备与纯化;（二）鼠的准备与要求;（三）超排卵与取卵;制定排卵程序： (1) 于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l 0单位的PMS； (2) 过48小时(第三天中午)腹腔内注入5—10单位的人hCG(注射后11—13 小时 后排卵)； (3) 令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再 重用，但成功率下降； (4) 检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。 ;2 受精卵的收集;（四） DNA显微注射;;;（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡 （厚约5mm）； （2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)； （3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中； （4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml； （5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）把待注射用的DNA装入注射管中；;（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养 液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射； 注射细胞数量越多越好； （9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待 注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种； （10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。;;;（五）体内接种;（3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)； （4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒； （5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内； （7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内； （8） 仔细紧密缝合创口， （9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。;;;（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率;优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何 病毒基因组片段，绝对安全 。 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不 表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。 ;二、胚胎干细胞方法;胚胎干细胞（embryonic s