新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂tcct对u251和a549细胞增殖、细胞周期及凋亡影响-effect of new histone deacetylase inhibitor tcct on proliferation, cell cycle and apoptosis of u251 and a549 cells.docxVIP

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2018-06-03 发布于上海
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新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂tcct对u251和a549细胞增殖、细胞周期及凋亡影响-effect of new histone deacetylase inhibitor tcct on proliferation, cell cycle and apoptosis of u251 and a549 cells.docx

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新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂tcct对u251和a549细胞增殖、细胞周期及凋亡影响-effect of new histone deacetylase inhibitor tcct on proliferation, cell cycle and apoptosis of u251 and a549 cells

1.3 主要仪器设备 182 实验方法 192.1 细胞培养 192.2 细胞种板 192.3 细胞加药 192.4RNA 提取202.5RNA 浓度及纯度检测202.6RT-PCR202.6.1 引物设计 202.6.2 构建 PT-PCR 反应体系及反应程式，RT-PCR212.6.3 琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 产物223 结果 224 讨论 23 第三部分 TCCT 对 U251 与 A549 细胞周期的影响 25 1 材料、仪器与试剂 251.1 癌细胞与药物 251.2 主要试剂 251.3 主要仪器设备 252 实验方法 262.1 细胞培养 262.2 细胞种板 262.3 细胞加药 262.4 细胞固定 272.5 PI 单染及上机检测272.6 统计学处理 273 结果 274 讨论 34 第四部分 TCCT 对 U251 与 A549 细胞凋亡的影响 35 1 材料、仪器与试剂 351.1 癌细胞与药物 351.2 主要试剂 351.3 主要仪器设备 352 实验方法 362.1 细胞培养 362.2 细胞种板 362.3 细胞加药 362.4 细胞前处理及上机 372.5 统计学处理 373 结果 374 讨论 42第五部分TCCT 对 U251 组蛋白乙酰化状态及细胞周期相关因子蛋白表达的影响 431 材料、仪器与试剂 431.1 癌细胞与药物 431.2 主要试剂 431.3 主要仪器设备 441.4 主要工作液配制 441.0M Tris-HCl（pH6.8）441.5M Tris-HCl（pH8.8）441.4.330%储备胶溶液 441.4.410%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液441.4.510%过硫酸铵(AP)溶液451.4.65×SDS电泳缓冲液451.4.715%分离胶配方 451.4.85%浓缩胶配制 451.4.910×转移缓冲液 451.4.1020%吐温(Tween)20 溶液461.4.11 TBST 缓冲液461.4.12 封闭液(5%脱脂奶粉) 462 实验方法 462.1 细胞培养 462.2 细胞种板 462.3 细胞加药 462.4 蛋白提取与定量 472.4.1 蛋白提取 472.4.2 蛋白定量 472.5 Western Blot472.5.1 灌制 SDS凝胶472.5.2 加样及电泳 472.5.3 转膜 482.5.4 封闭及抗体孵育 482.5.5 发光、曝光及显影 483 结果 494 讨论 49结论 51参考文献 52攻读学位期间发表的论文 56附录缩略词表 57致谢 58新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TCCT 对 U251 和 A549 细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响中文摘要组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学重要的组成部分，主要由组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylases，HDACs)和组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferases，HATs）催化完成，二者的调控共同维持着组蛋白乙酰化状态的平衡，此时基因的转录在一个相对稳定可控的范围内进行。一旦这种平衡被打破，如 HDACs 发生过表达或 HATs 活性降低将导致的组蛋白低乙酰化，这种情况下，低乙酰化的组蛋白与 DNA 紧密结合，染色体发生凝聚，转录因子与 DNA 的结合变得困难，基因的转录随之受到抑制，这种乙酰化状态的改变导致的基因转录异常在诱导肿瘤发生中起到了重要作用。鉴于此，针对 HDACs 靶点的药物—组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）的研究成为抗肿瘤领域的热点和重要方向。2，2，3，3—四甲基环丙酰硫脲（TCCT）系在短链脂肪酸类 HDACi——丙戊酸（VPA）进行结构改造而得到的衍生物，前期研究已发现其抑制 U251 及 A549 细胞中Ⅰ类 HDACs——HDAC3 与Ⅱ类 HDACs——HDAC4 的表达[1]，属新型 HDACi。本课题组选取人脑胶质瘤 U251 与肺腺癌 A549 细胞为实验对象，采用体外药效学评价方法研究 TCCT 的体外抗肿瘤作用，并对其抗肿瘤作用机制进行了初步探讨，为能开发新型 HDACi 类抗肿瘤药物奠定基础。目的：通过研究新型 HDACi—TCCT 对人脑胶质瘤 U251 细胞与人肺腺癌 A549 细胞增殖的影响、TCCT 对 U251 与 A549 细胞细胞周期相关因子的表达的影响及 TCCT 对 U251 与 A549 细胞周期进程及细胞凋亡的影响，探讨 TCCT 的抗肿瘤作用及可能机制。方法：人脑胶质瘤 U251 与人肺腺癌 A549 细胞分别用含