血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pires-sj97-sj14-sj26免疫保护作用的分析和日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌bl-21中的表达-analysis of immune protection of schistosoma japonicum multi-gene non-fusion membrane anchored expression vaccine pires - sj97 - sj14 - sj26 .docxVIP

1. 1 材料…………………………………………………………………………………… 251. 2 实验方法………………………………………………………………………………261.2.1 Sj14 基因的扩增…………………………………………………………………… 261.2.2 pET- Sj14 的构建…………………………………………………………………261.2.3 重组质粒pET-Sj14的转化…………………………………………………………271.2.4 重组质粒pET-Sj14的PCR鉴定和酶切鉴定……………………………………… 271.2.5重组质粒pET-Sj14 的原核表达……………………………………………………271.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物…………………………………………27.结果……………………………………………………………………………………… 28.讨论……………………………………………………………………………………… 30参考文献………………………………………………………………………………… 31综述……………………………………………………………………………………… 33 致谢…………………………………………………………………………………………44 附录…………………………………………………………………………………………45第一部分：血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 免疫保护作用的研究摘要目的 大量提取并纯化 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 质粒,并用此质粒肌注免疫 BALB／c 小鼠，研究其免疫原性及免疫保护作用，为日本血吸虫病的防治寻求新的多基因 组合疫苗的免疫策略。方法 大量提取并纯化 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 质粒，并用此质粒肌注免疫 BALB／ c 小鼠,同时设生理盐水组和空载体为对照,每组 20 只小鼠。每隔 2 周加强免疫 1 次,共免疫 3 次,末次免疫 2 周后,每组随机取 10 只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴 细胞及腹腔巨噬细胞。以 ELISA 试剂盒检测免疫小鼠血清中总 IgG 抗体及脾淋巴 细胞培养上清干扰素(IFN)-γ 的水平,以淋巴细胞刺激指数(SI)反应细胞增值能力,以 NO 释放量检测巨噬细胞吞噬活性,并以 FCM 分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下每 只小鼠经腹部感染 40 土 1 条尾蚴，尾蚴攻击感染 45 d 后，经肠系膜静脉灌注法和 压片法收集血吸虫成虫，留取肝脏备用。分别计算每只小鼠中收集的血吸虫成虫 数，计算每组小鼠的平均成虫数，按下式计算减虫率:减虫率 = (对照组平均获成虫 数-实验组平均获成虫数)／对照组平均检获成虫数×100 ％。称取鼠肝总重量，按 常规方法用 5％氢氧化钾消化肝组织，计算每克肝组织虫卵数(EPG)，按下式计算 减卵率：减卵率= (对照组平均 EPG-实验组平均 EPG)／对照组平均 EPG×100％。 结果 免疫小鼠后 ELISA 法检测抗体结果表明 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 疫苗组较各 对照组诱导产生高水平的 IgG 抗体（P0.01,P0.05）.该组的脾淋巴细胞刺激指数 较各对照组也有显著增高(P0.01),INF-γ 的水平与其他两个对照组有显著差异 (P0.01) 。 CD4+和 CD8+细胞百分比有明显增高（P0.01）。实验组小鼠 NO 含 量较对照组明显提高(P0.05) 。实验组小鼠减虫率 39.9％和减卵率 43.94％均较对 照组明显升高(P0.01)结论 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 疫苗具有较强的免疫原性,能明显增强 BALB/c 小鼠的 免疫应答反应，并能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。 关键词: 日本血吸虫 ;多基因DNA疫苗; 免疫保护作用Study on Multi-gene DNA Vaccine pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 Encoding Uncombiant Membrane-anchoring Antigen against Schistosoma JaponicumAbstractObjective To abstract and purify plasmid pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 .Immunize mice with pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 and study its immunogenicity and protective immunity in mice in order to find a new strategy to prevent and cure Schi