鸭瘟病毒tk基因转录与表达时相及tk重组蛋白elisa方法的建立和应用-transcription and expression of duck plague virus tk gene and establishment and application of tk recombinant protein elisa.docxVIP

论文独创性声明本人郑重声明:所里交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:多乡φz()!o 年 j 月儿日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。向意四川农业大学可以用不 同方式在不问媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名:做手 导师签名:在呢书μ/，年6 月 2 2.日to(o 年d 月 2之日喇喇唰FOmM川句 。mwM码，嗣唰唰唰唰AE·唰唰唰nu川 川川00川附附肌AE·恻川Y本论文的创新性工作1.通过荧光定量PCR (FQ PCR) 与蛋白印迹 (Western-blot) 分析了DPY TK 慕 因在DEF中的转录与表达时相。提取感染 DPY厉的鸭胚成纤维细胞刚 A ，反转笨得cDNA ， SYBR Green 1 染料法进行荧光定量 PCR扩增。发现该基因最早在感染后 30min开始转 录，随后转录产物最迅速增加，并于感染后 4h达到高峰， 36h后其相对含量下降到一 定水平，72h转录产物极少;同时，用蛋白印迹对 TK基因作表达时相分析，发现从 6h 开始大量表达， 8h达到表达的高峰，随后持续下降直到 48h 。转录与表达时相共同证 明了四基因具备痛磅病毒早期基因的典型特征。2. 应用TK基因意组蛋白建立了检测鸭瘟病毒抗体的 ELISA方法。通过特异性实 验、敏感性实验、重复性实验证明了本研究建立的 TK-ELISA 方法具有良好的特异性、 敏感性、可蠢复性。对 30份疑似感染鸭瘟血清临床样本检测，阳性检出率为 90% (27/30) ，丁K-ELISA 与血清中和试验 (SNT) 显示出83.33% 的符合率，与全病毒包被的 ELISA(DPY-ELISA) 显示出90%的符合率。通过免疫活疫苗，用 TK ELISA检测发现在第 4 周抗体达最高峰。实验表明，利用 TK 蛋白作为包被抗原，较传统的 DPY-ELISA 及SNT 更使捷、经济。γ鸭瘟病毒 TK 基因转荣与表达时相及丁K 重组蛋白 ELISA 方法的建立和应用硕士研究生:文永平指导老师:汪铭书教授 程安春教授中文摘要本文对本研究小组前期鉴定、表达出的鸭瘟病毒 (Duck plague vírus ，DPV) 胸背 激酶 CThymidine Kinase，TK) 基因、 TK 重组蛋白展开了以下系列研究: DPV TK 基 因在鸭胚成纤维细胞 (Duck Embryo Fibroblast ，DEF) 中的转录与表达时相分析; TK 意组蛋白作为包被抗原建立 TK-ELISA 检测 DP 抗体。结果如下:1.荧光定量 PCR (FQ-PCR) 与蛋白印迹 CWestern翩blot) 分析。PV TK 基因 的转录与表达时相。转录时相显示 DPV TK 基因最早在感染后 30min 开始转录，随后 转录产物最迅速增加，并于感染后 4h 达到高峰， 36h 后其相对含量下降到…定水平， 72h 转录产物极少;表达时相显示感染后从 6h 开始大量表达， 8h 达到表达的高峰， 随后持续下降直到 48ho 转录与表达时相共同证明丁 K 基因具备痛磨病毒早期基因的 典型特征。2. TK熏组蛋白作为包被抗原建立 TK-ELISA方法。结果表明，最佳包被抗原稀 释倍数、血清稀释倍数、酶标工抗稀释倍数分别为:2.5μg /100μ1 (1 :200) 、1:80 及 1:20000 通过用建立的丁K-ELISA 检测鸭病毒性肝炎病毒 (DHV) 、鸭乙型肝炎病毒 (DHBV) 、鸭疫里默氏菌(且A)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭沙门氏商(S.anatum) 血清， 并与鸭瘟病毒 (DPV) 血清对照，显示出丁 K-ELISA具有良好的特异性。对一份鸭阳性 血清做梯度稀释，依照临界值 (0.401)，最大能检测出 1: 2560的稀释度。通过免疫 活疫苗，用TK-ELISA检测发现在第4周抗体达最高峰。对 30份疑似感染鸭瘟血清临床 样本检测，阳性检出率为 90% (27/30) ，TK-ELISA 与血清中和试验 (SNT) 显示出83.33% 的符合率，与全病毒包被的 ELISA(DPV-ELISA) 显