阳离子聚合物β-cd-pamam作为神经母瘤细胞基因载体评估-evaluation of cationic polymer β - cd - pamam as gene vector for neuroblastoma cells.docxVIP

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2018-06-03 发布于上海
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阳离子聚合物β-cd-pamam作为神经母瘤细胞基因载体评估-evaluation of cationic polymer β - cd - pamam as gene vector for neuroblastoma cells

因此，我们化学合成星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM，研究其负载质粒DNA能力，并检测其形成纳米复合体的粒径、zeta-电位、形态和结构；同时在体外检测了其细胞毒性和转染效率，进一步研究了血清对转染效率的影响。本课题内容分为两部分：1.星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM与DNA形成复合物后的理化性质；2.星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM作为质粒DNA传输载体的体外实验研究；第1章星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM与DNA形成复合物后的理化性质目的检测星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM与DNA形成复合物后的理化特性，并进一步研究其负载质粒DNA的能力。方法按照一定的N/P比(N/P比是指阳离子聚合物中的NH4+与DNA中的PO3-摩尔比例)，阳离子聚合物β-CD-PAMAM与DNA均匀混合形成复合物后，在ZetaPALS-电位分析仪上测定纳米复合体的粒径和表面电荷。电子透射显微镜观察β-CD-PAMAM与DNA在N/P为10形成纳米复合体的形态和结构。并通过琼脂糖凝胶电泳实验研究β-CD-PAMAM负载质粒DNA的能力。结果1.纳米材料复合体的粒径和zeta-电位β-CD-PAMAM/DNA纳米复合体粒径随着N/P从1到30的增大而减小，大约在100-200nm之间；β-CD-PAMAM/DNA纳米复合体表面电荷随着N/P从1到30的增大而增大，从此结果看β-CD-PAMAM/DNA结合稳定。2.纳米材料复合物的形态和结构通过电子透射显微镜观察β-CD-PAMAM/pEGFP-N3在N/P比为10形成的纳米复合体大小不超过200nm，呈圆球形，结构紧密，在基因转染中有利于细胞内吞。3.琼脂糖凝胶电泳β-CD-PAMAM和DNA在N/P比为10即达到完全结合，琼脂糖凝胶电泳显示质粒DNA被阻滞在上样孔内，所以在N/P=10时，β-CD-PAMAM就可以作为基因转染的载体。结论合成的星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM可以用于DNA转染，为在体外检测其细胞毒性和转染效率、以便了解β-CD-PAMAM的基因转染效率及细胞毒性作用打下理论和实践基础。第2章β-CD-PAMAM作为质粒DNA传输载体的体外实验研究目的检测纳米材料β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/pEGFP-N3复合物在体外对细胞的毒性大小及其转染效率，为进一步体内基因治疗做准备。方法标准的非病毒载体聚酰胺-胺型树状物PAMAM[43,44,45]作为阳性对照组，在体外培养人胚肾细胞Hek293细胞和神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞，并制备含有EGFP基因的表达载体pEGFP-N3，利用噻唑蓝(MTT)比色实验研究纳米材料β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/PEGFP-N3复合物的细胞毒性作用；然后分别应用β-CD-PAMAM和PAMAM两种载体将pEGFP-N3转染到不含血清培养和含血清培养的人胚肾细胞Hek293细胞和神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞中，转染后于24h分别用流式细胞仪检测转染效率，激光共聚焦显微镜和倒置荧光显微镜观察转染效果。结果1.细胞毒性试验：在两种细胞中，N/P10时，所有纳米材料载体和其复合物都显示出其低毒性，细胞存活率在80%以上(P0.05)；在N/P20时，β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/pEGFP-N3复合物的细胞存活率比PAMAM和PAMAM/pEGFP-N3复合物高(P0.05)。2.细胞转染试验：在N/P为20、30、40结合的β-CD-PAMAM/DNA复合物转染SH-SY5Y细胞的转染效率都比PAMAM与pEGFP-N3在N/P=20结合的复合物高，其中，复合物在N/P=20的细胞转染效率最大，达到20%(P0.05)。而在相同的N/P结合的复合物转染两种细胞，含10%FBS的DMEM培养基转染效率比不含FBS的DMEM培养基有轻度的增高。但通过T检验分析，两者在统计学上没有显著的统计学差异(P0.05)。激光共聚焦显微镜和倒置荧光显微镜更直观的显示出以上的转染结果。结论明确了β-CD-PAMAM的细胞毒性作用及基因转染效率，证实β-CD-PAMAM可以作为Hek293和SH-SY5Y细胞基因传输的载体，可进一步于动物体内进行联合基因治疗多发性硬化EAE模型。关键词星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM，神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞，细胞毒性试验，体外基因转染Evaluationabouttheemploymentofcationicpolymerβ-CD-PAMAMasgenecarrierofneuroblastomatumorcellsMajor:NeurologyPostgraduate：LiWeiTutor：Prof.CongGaoInstituteofNeurosciencest