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生物医学ESR自旋捕集技术运用(共15686字) 1ESR自旋捕集技术 所谓自旋捕集技术就是为了检测和辩认短寿命自由基,将一种不饱合的抗磁性物质(称自旋捕集剂,一般为氮酮和亚硝基化合物),加入要研究的反应体系,生成寿命较长的自旋加合物,可以用ESR检测.现在已经合成上百种自旋捕集剂,最常用的自旋捕集剂有tNB(nitroso-tert-bu-tane),DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide),PBN(phenyl-tert-butynitrone)等(如图1),它们和自由基反应都可以生成氮氧自由基,所得ESR波谱的一级分裂都是氮原子引起的三重分裂,这一点和自旋标记所得到的ESR波谱很类似.但是自旋加合物的ESR波谱常常被分裂为二、三级更复杂的图谱,由二、三级分裂峰值的数目和强度可以推导出捕捉到自由基的结构和性质. 1.1氧自由基的捕捉 超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能和与多种疾病有密切相关,而且它还是所有氧自由基中的第一个自由基,可以经过一系列反应生成其它氧自由基,因此具有特别重要的生物功能和意义.羟基自由基是已知的最强的氧化剂,它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强,是氧气的三电子还原产物,反应性极强,几乎可以和所有细胞成分发生反应,对机体危害极大.因此,这2种自由基是利用自由基捕集技术研究最多的.DMPO是一种对氧自由基捕集效率很高的自旋捕集剂,而且形成的自旋加合物,DMPO-OH,DMPO-OOH,有特征的超精细分裂图谱和超精细分裂常数.DMPO-OH的ESR波谱由4条谱线组成,强度比为1∶2∶2∶1,这是由于N的超精细分裂常数等于H的超精细分裂常数的结果(aN=aH=1.49mT)(图2),是用ESR技术判别羟基自由基的重要标志[1-7].超氧阴离子自由基DMPO自旋加合物的典型ESR波谱,DMPO-OOH的ESR波谱是由4组12条谱线组成的,其中aN=1.43mT,aHβ=1.17mT,aHγ=0.125mT.这类ESR波谱常被人们用来检验一个体系是否有超氧阴离子自由基产生的判据(图3)[1-7].DMPO自旋加合物不稳定,很难用于体内氧自由基检测,针对这一缺点,人们又合成了一系列新的自旋捕集剂,比较成功的有5-(Diethoxyphosphoryl)-5′-methyl-1-pyrro-lineN-oxide(DEPMPO),5-tert-butoxycarbonyl5-methyl-1-pyrrolineN-oxide(BMPO)和5-ethoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrrolineN-oxide(EMPO)[1];利用这些自旋捕集剂可以得到比较稳定的可以检测的ESR波谱(图4). 1.2脂类自由基捕集 脂质过氧化是一个产生自由基和自由基参与的链式反应.过去人们研究脂质过氧化一般都采用TBA(thiobarbituricacid)法检测脂质过氧化产生的最终产物之一MDA(ma-lonaldehyde),这样很难深入研究脂质过氧化的自由基机理.利用4-POBN(4-pyridyl-1-oxide-N-t-butylnitrone)自旋捕集剂在亚油酸,脂质体微粒体,突触体和红细胞膜等体系中捕捉到了脂质过氧化产生的脂类自由基(图5),研究了它们产生的机理及天然抗氧化剂对脂类自由基的清除作用机理[1-4,8-10]. 1.3单线态氧的捕集 单线态氧虽然不是自由基,但是高度活性常常反应产生自由基.利用叔胺四甲基哌啶(TEMPONE)可以特异地检测单线态氧,是3条等强度的ESR谱线组成的(图6).为了证明体系中确实有单线态氧产生,往往还需要单线态氧的清除剂———胡萝卜素证明.另外,四甲基乙烯(TME)、2,5二甲基呋喃(DMF)、9,10-二苯基蒽(DPA)等也可以淬灭单线态氧,用以证实单线态氧的存在.单线态氧在D2O中的寿命要比在H2O中长10~15数量级,这也是鉴别单线态氧存在的一个重要方法.若在反应体系中加入D2O,用ESR检测单线态氧产率增大,进一步证明体系中确实有单线态氧产生[1-4,10]. 1.4NO自由基的检测 NO是内皮细胞松弛因子,能够松弛血管平滑肌,防止血小板凝聚,是神经传导的逆信使,在学习和记忆过程及免疫和疾病中发挥着重要作用.NO是自由基,但由于它的自旋和轨道角动量偶合不能用ESR直接检测.有3种ESR技术可以检测溶液中的NO,一种就是传统的氮氧自由基自旋捕集NO自由基,另一种是用铁盐络合物.前者可以和NO反应生成自旋加合物自由基,对化学体系产生的NO自由基捕集效果很好,但是很难用于细胞和生物体系;后者已经成功地用于检测体内产生的NO自由基了.我们利用血红蛋