干扰素PPT课件.pptVIP

* 第十三节　基因工程药物制造实例 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b α2a α2b等亚型。 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） ??毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症rhuIFNβ 2、重组干扰素的临床应用 体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞 3、干扰素生产工艺路线（1） 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性 人源转化细胞系培养生产工艺： 3、干扰素生产工艺路线（2） 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺： 3、干扰素生产工艺路线（3） 上市产品：重组人干扰素rhuIFN ??1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b； ??1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； ??2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 3、干扰素生产工艺路线（4） 动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFNβ-1a ??1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono) 表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格 中华仓鼠卵母细胞 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性 工艺特点： ??发酵周期短：几个小时 ??无需变性、复性过程，获得有活性产品 3、干扰素生产工艺路线（5） 1、基因工程假单胞杆菌菌种建立 2、菌种库的建立与保藏 3.1 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第一步：干扰素α-2b基因的克隆 P73 图2－13 1、基因工程菌菌种建立 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA 蔗糖密度梯度离心提取12s的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒DNA的PstI酶切割加上dA或dC 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR) 制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。 1、基因工程假单胞菌菌种建立 ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGC TCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACAT GACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAAC CATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAA AGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACTGAAC TCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGT GACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACT TCCAAAGAATCACCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGG AGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAG AAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA 第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体 1、基因工程假单胞杆菌菌种建立 第三步：工程菌构建 转化假单胞菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种 1、基因工程假单胞菌菌种建立 2、菌种库的建立与保藏 品质控制（QC）：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种