基因操作及其医学应用2义.pptxVIP

转基因和基因治疗内 容 提 纲 转基因和基因治疗 1．概念和研究现状 2．基因治疗的基本类型 3．转基因的基本方法 4. 转基因的表达和调控 5．基因治疗的运用和前景转基因及基因治疗基 本 概 念 基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。 转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。转基因及基因治疗基因治疗的程序目的基因viralnonviral转基因In vivoex vivo基因表达体内调控基因治疗基因治疗的基本类型★细胞介导的基因治疗(ex Vivo)是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。★体外表达基因治疗 (in Vitro) 是传统的基因表达形式。转基因的基本方法病毒法(Viral)和非病毒法(Nonviral)转基因及基因治疗转基因的基本方法1、病毒法(Viral) 1)逆转录病毒(Restrovirus) RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell转基因及基因治疗基因治疗的基本类型 ★ 体内直接转基因治疗（in Vivo） 是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。转基因及基因治疗转基因的基本方法优势： ① 整合率高; ② 对外源DNA影响小; ③ 单拷贝整合，利于表达调控； ④ 安全。转基因及基因治疗转基因的基本方法劣势： ① 容量小; ② 只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因; ③ Transite expression; ④ R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。转基因及基因治疗转基因的基本方法 2） 腺病毒(Adenovirus) 腺相关病毒(Adenoassociated virus) DNA病毒 E1和E3基因缺乏　 263细胞系生长转基因及基因治疗转基因的基本方法特点： ① 能感染静止细胞，体内(in vivo)转基因 ② 对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗 ③ 包容量大 ④ 尚无Packaging Cell，欠安全 ⑤ 有较强免疫原性，易引起体内免疫反应转基因及基因治疗转基因的基本方法2、非病毒法(Nonviral) 1）显微注射法(Microinjection) 2) 基因定位整合技术(Gene targeting) 3) 受体介导(Receptor-mediated methods) 4) 组织内直接注射(Direct injection of DNA) 5) 磷酸钙沉淀法(CaPO4 precipitation)基因定位整合技术（基因打靶Gene Targeting)基因打靶的概念通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knockin）。基因打靶的必要条件打靶载体 打靶载体中的必要成分： 载体DNA 目的基因同源片段 筛选标志基因 neu（新霉素）阳性筛选标志基因； HSV-tk阴性筛选标志基因。胚胎干细胞基因敲除的基本程序 1、构建打靶载体 A.获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中； B.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端； C.将neu基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间； D.在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。2、打靶载体导入ES细胞3、基因敲除ES细胞注射入胚泡4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中5、嵌合体的杂交育种转基因及基因治疗转基因的基本方法 附 表 外源DNA的整合 Table 1. Methods of delivering genes into mammalian cells and likely applications in gene therapy(+).Major application: (+/-), some application; (-). Little or no application; T. only transient expression; S. stable expression Science,Vol.260:14 May,1993转基因及基因治疗转基因的表达和调控 1. 启动子(promoter) 选用或设计适当地强启动子能使外源性基因在宿主体内高效表达。 2．内含子(intron) 在转基因过程中，内含子可增强基因表达。转基因及基因治疗