乙酰化介导的家蚕bm30k-3蛋白稳定性机制及抗凋亡功能分析-stability mechanism and anti-apoptotic function of bm30k - 3 protein mediated by acetylation in silkworm, bombyx mori.docxVIP

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乙酰化介导的家蚕bm30k-3蛋白稳定性机制及抗凋亡功能分析-stability mechanism and anti-apoptotic function of bm30k - 3 protein mediated by acetylation in silkworm, bombyx mori

学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用影 印、缩印成扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名: 签字日期:2016 年 3 月 11 日导师签名: 签字日期:2016 年 3 月 11 日摘要蛋白质乙酰化修饰是蛋白质上的赖氨酸残基在乙酰基转移酶的催化下,添加 一个乙酰基的共价修饰过程,是一种保守的蛋白质翻译后修饰机制。研究发现, 组蛋白的乙酰化/去乙酰化与肿瘤的发生有着紧密的联系。而随着检测技术的进 步,非组蛋白的乙酰化修饰已经越来越被人们所重视。研究乙酰化修饰对非组蛋 白的影响已经成为乙酰化研究的主流。大量研究表明,乙酰化修饰能够竞争蛋白 的赖氨酸泛素化位点,抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高蛋白的稳定 性,增加蛋白的细胞含量。本课题前期研究通过 乙酰化肽段富集技术和 nano-HPLC/MS/MS 鉴定了家蚕总蛋白的乙酰化位点。从鉴定数据中,我们发现 Bm30K-3 蛋白存在多个乙酰化位点。本课题主要开展乙酰化修饰对 Bm30K-3 蛋 白稳定性的影响及其可能的分子机制研究。首先,利用 PCR 的方法从家蚕 cDNA 文库中扩增了 Bm30K-3 基因,将其克 隆至 pIEX-1 多克隆位点后经 Sca I 单酶切再与 pFastBacHT B 单酶切回收产物连 接获得重组转移载体 pFastBacHT B-ie1-Bm30K-3,通过 Bac-to-Bac 系统构建获得 由极早期启动子 ie1 驱动表达的重组家蚕杆状病毒 ie1-bacmid-Bm30K-3。Western Blotting 结果分析表明,与 His 融合的目的蛋白 His-Bm30K-3 获得成功表达。随后,我们分别使用去乙酰化酶抑制剂 TSA 和乙酰化酶抑制剂 C646 上调及 下调重组病毒 ie1-bacmid-Bm30K-3 感染 BmN 细胞的乙酰化水平,研究乙酰化水 平变化对细胞内 Bm30K-3 蛋白含量的影响,结果表明:乙酰化水平上调后 Bm30K-3 蛋白含量上升,且随着乙酰化水平下调 Bm30K-3 蛋白含量也下降,表 明 乙 酰 化 可 以 上 调 Bm30K-3 蛋 白 的 细 胞 含 量 。 为 了 进 一 步 分 析 乙 酰 化 对 Bm30K-3 含量变化影响的分子机制,我们使用蛋白质合成抑制剂 Cycloheximide(CHX)和蛋白酶体抑制剂 MG132 进一步处理 TSA 处理过的 BmN 细胞,通过 对 Bm30K-3 降解曲线和累积曲线的分析,我们推测乙酰化通过影响蛋白的泛素 化水平来调控蛋白含量的变化。随后,我们采用 His 抗体免疫沉淀获得正常感染 细胞与上下调乙酰化水平感染细胞中的 Bm30K-3 蛋白,经 Western Blotting 检测 Bm30K-3 乙酰化及泛素化水平,表明 TSA 处理后乙酰化的上调伴随着蛋白泛素 化水平的下调,即二者存在互作关系,进一步证明了上一步实验的结论。综合上I述结果表明,Bm30K-3 蛋白的乙酰化可能通过竞争蛋白的泛素化修饰,抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高蛋白的稳定性,增加蛋白的细胞含量。 由于 30K 蛋白具有抗细胞凋亡的活性,我们建立了 H2O2 诱导的家蚕 BmN细胞凋亡模型,研究 Bm30K-3 蛋白抗氧化应激诱导的细胞凋亡的作用以及乙酰化对其抗凋亡活性的影响。MTT 法及 Caspase-3/7 检测试剂盒检测的结果表明, Bm30K-3 蛋白可以在一定的程度上增强家蚕 BmN 细胞的活力,而且随着转染质 粒量的提高,BmN 细胞的活性会有一定的提升,表明 Bm30K-3 蛋白同样具有抗 细胞凋亡的活性。随后使用两种抑制剂 TSA/C646 研究 Bm30K-3 的乙酰化水平 对其抗凋亡能力的影响,结果显示,乙酰化水平上调后,Bm30K-3 蛋白的抗凋 亡能力提升,而乙酰化水平下调后,其抗凋亡能力下降,而且抗凋亡活性上下调 的幅度差异较显著,表明乙酰化修饰具有提高 Bm30K-3 蛋白抗细胞凋亡的能力, 结合前面的研究结果,推测其机制可能是由于乙酰化修饰增强了 Bm30K-3 蛋白 的稳定性并提高蛋白的细胞含量所致。本课题首次开展了家蚕 Bm30K-3 蛋白的 乙酰化修饰功能研究,为进一步研究和发现乙酰化对家蚕营养储藏蛋白的功能机 制奠定基础。关键词:家蚕;乙酰化;非组蛋白;Bm30K-3;泛素化;细胞凋亡IIAbstractLysine acetylation is a conservativ

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