荧光原位杂交ppt课件.pptVIP

L/O/G/O 荧光原位杂交（FISH） Fluorescence in situ hybridization 以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。 FISH原理 FISH发展 1969年，同位素标记的DNA探针； 1974年，染色体显带技术与原位杂交结合； 1981年，荧光素标记的cDNA探针； 90年代后，多色探针出现。 探针的发展 放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（P32），档标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致北京过高而难以分辨出真正信号。 非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连接到 dUTP 等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等 探针制备 所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧