药敏试验ppt课件.ppt

实 验 结 果 讨 论 实验十一 细菌的药敏实验及耐药表型检测 实 验 目 的 一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。 实 验 方 法 药物敏感试验 目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法包括 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱 β-内酰胺酶（ESBL）的检测和β-内酰胺酶的检测。 药物敏感试验 药敏试验方法 纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法 稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。 检测细菌耐药性的方法 超广谱 β-内酰胺酶（ESBL）的检测 β-内酰胺酶的检测 实 验 方 法 平板扩散法 　1 可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌 混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般每个平皿贴4片，每种药敏片的名称要记住。  3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。  平板扩散法 　4 抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔生长的边缘为界，用的卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不计。复方新诺明抑菌环内会有轻微细菌生长，小于20％左右可忽略不计。 5 结果报告：，抑菌环直径的大小可以反应MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法MIC值的判断标准报告敏感、耐药和中介。 常量肉汤稀释法 1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。 常量肉汤稀释法 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。 常量肉汤稀释法 4.接种物的制备 直接菌落悬液配制法，直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物。 E、附：0.5麦氏比浊管配制方法 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。 有效期为6个月。 F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 G、孵育 1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 H、结果判断与解释 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。 在临床微生