荧光显微镜二反射荧光显微镜光源高压汞灯或卤素灯聚光镜.PPT

荧光显微镜 马明 053004 荧光显微镜的发明 1941年 Coons(昆氏)：将抗体加上萤光染剂用以侦测细胞抗原。 这是荧光显微镜的最早雏形。 荧光显微镜的成像原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 荧光的作用： 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。 荧光的性质 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光染色分类： 自发荧光 二次荧光 抗体荧光技术 自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。 荧光的种类 抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 荧光显微镜的分类及构造 一.透射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。 物镜：可用任何种类的物镜。 标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。 透射荧光显微镜 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 透射荧光显微镜原理 透射荧光显微镜的构造 优点： 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。 缺点： 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 厚的或不透明的标本不适用。 不过现在透射式显微镜几乎已经被淘汰，被更先进的反射式（落射式）荧光显微镜所代替。 荧光显微镜 二.反射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 反射荧光显微镜原理 反射荧光显微镜的构造 优点： 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 缺点： 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） LSCM的发展历史 1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦 显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。 1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。 1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。 1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可 以消除焦点模糊，得到清晰的图像。 1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜 共聚焦显微镜优势 共聚焦显微镜原理简介 共聚焦与传统显微镜的原理差别 照明方式不同：传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟 LSCM采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个