鱼藤素和冬凌草甲素靶向npm1突变蛋白——治疗npmc急性髓系白血病作用机理研究-rotein and oridonin targeting np m1 mutant protein - study on mechanism of action in treating acute myeloid leukemia of npmc.docx

目录英文缩略词简表1中文摘要3ABSTRACT6前言9第一部分鱼藤素特异性下调NPM突变蛋白促进NPMc+急性髓系白血病的凋亡及诱导分化14材料与方法14结果22讨论37参考文献39第二部分冬凌草甲素对NPMc+急性髓系白血病NPM1突变蛋白异常定位的调节作用43材料与方法43结果48讨论58参考文献60综述63致谢75附录攻读博士学位期间发表文章与会议报告76英文缩略词简表NPM1Nucleophosmin核磷蛋白NPM-wtNucleophosmin-wildtype核磷蛋白-野生型NPM-mutNucleophosmin-mutant核磷蛋白-突变型NPMc+Nucleophosmincytoplasmpositive核磷蛋白胞浆阳性NupsNucleoporins核孔蛋白Nup98Nucleoporin98核孔蛋白98AMLAcuteMyeloidLeukemia急性髓系细胞白血病NK-AMLNormalKaryotype--AcuteMyeloidLeukemia正常核型的急性髓系细胞白血病MTT3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumBromide噻唑蓝DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜ODOpticalDensity光密度FITCFluoresceinIsothiocynate异硫氰酸荧光素PIPropidiumIodide碘化丙啶BSABovineSerumAlbumin，牛血清白蛋白粉剂SDSSodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；ECLElectroluminescence电化学发光RT-PCRReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction逆转录聚合酶链式反应Real-timeRT-PCRRealTimeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction实时定量逆转录聚合酶链式反应NESNuclearExportSignal核输出信号NLSNuclearLocalizationSignal核定位信号鱼藤素和冬凌草甲素靶向NPM1突变蛋白——治疗NPMc+急性髓系白血病的作用机理研究华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所博士研究生易莎导师陈燕教授中文摘要第一部分鱼藤素特异性下调NPM1突变蛋白促进NPMc+急性髓系白血病的凋亡及诱导分化目的：核磷蛋白（NPM1）是一种广泛存在于细胞核内的磷酸蛋白，穿梭于核仁、核质和胞浆之间，具有多种生物学功能。在接近1/3的急性髓系细胞白血病患者中，NPM1蛋白突变导致NPM1异常的胞浆聚集，是NPMc+AML发病的重要原因。本实验主要研究鱼藤素(deguelin)对急性髓系细胞白血病（AML）细胞OCI-AML3（具有NPM1蛋白突变）及OCIM2（NPM1野生型）的细胞凋亡，细胞分化，NPM1野生型蛋白，NPM1突变型蛋白的影响，探讨其抗肿瘤机制。方法：采用MTT比色法及台盼蓝染色法检测鱼藤素作用后AML细胞OCI-AML3及OCIM2细胞的增殖及活性；AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡；瑞氏-吉姆萨染色，CD11b，CD14分化抗原流式细胞术检测细胞分化；分光光度法检测Caspase-6和Caspase-8活性；Westernblot免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白PARP，Caspase3的表达，分化相关蛋白p53，p21，C/EBPα的表达以及NPM1总蛋白，野生型及突变型蛋白的表达水平；siRNA特异性沉默OCI-AML3细胞NPM1突变蛋白，检测OCI-AML3细胞增殖，细胞分化及分化相关蛋白的表达情况；结果：鱼藤素对NPMc+的AML细胞OCI-AML3具有明显抑制作用，可显著下调NPM1突变蛋白的表达，而冬凌草甲素，雷公藤内酯醇及白桦脂酸对OCI-AML3NPM1突变蛋白及野生型蛋白表达均无影响；在高浓度情况下，鱼藤素可明显促进OCI-AML3细胞的凋亡，OCI-AML2相对不敏感，OCI-AML3的凋亡伴随有Caspase-6，Caspase-8活性上调，NPM-mut蛋白特异性下调；而在低浓度情况下，鱼藤素则可诱导OCI-AML3细胞分化，对无NPM1突变OCIM2细胞无此作用，该分化作用可能与Caspase-8活性升高，p53，p21及30kDC/EBPα表达水平下降有关。SiNPM-mut沉默OCI-AML3，可抑制细胞增殖并促进细胞分化，并可下调p53，p21及30kDC/EBPα蛋白表达，激活Caspase-8活性。结论：与NPM1未突变急性白血病相比，OC