原代胚胎干细胞小鼠f0-esc mouse的培育及其方法学研究-cultivation of primary embryonic stem cell mouse f0 - esc mouse and its methodology study.docxVIP

目录英文缩略词表………………………………………………………….2中文摘要…………………………………………………………..........3Abstract…………………………………………………………4前言………………………………………………………….................6材料与方法…………………………………………………………….8结果……………………………………………………………………25讨论……………………………………………………………………32结论……………………………………………………………………36参考文献………………………………………………………………37综述……………………………………………………………………41参考文献………………………………………………………………45致谢………………………………………………………….................472中英文缩略词表BSADMEMbovineserumalbuminDulbecco’SModifiedEagleMedium牛血清白蛋白极限必需培养基DMSOEDTAEGFPESCFBSdimethylsulfoxideethylenediaminetetraaceticacidenhancedgreemfluorescenceproteinembryonicstemcellFetalBovineSerum二甲基亚砜乙二胺四乙酸增强型绿色荧光蛋白胚胎干细胞胎牛血清HCGICML-GLULIFMEFhumanchorionicgonadotropininnercellmassL-glutamineleukaemiainhibitoryfactormouseembryonicfibroblast人绒毛膜促性腺激素内细胞团左旋谷氨酰胺白血病抑制因子小鼠胚胎成纤维细胞MinMMCNEAAPBSPMEFminuteMitomycin-CNonEssentialAminoAcidphosphatebufferedsalineprimarymouseembryonicfibroblast分钟丝裂霉素C非必需氨基酸磷酸缓冲生理盐溶液原代小鼠胚胎成纤维细胞PMSGRpmTEpregnantmareserumgonadotrophinrevolutionsperminuteTrophectoderm孕马血清促性腺激素每分钟转速滋养外胚层3原代胚胎干细胞小鼠（F0-ESCmouse）的培育及其方法学研究中文摘要目的利用Velocimouse技术原代（F0）培育完全来源于胚胎干细胞的小鼠（F0-ESC小鼠），分析探讨该技术的相应技术细节，以便为胚胎干细胞、诱导多能干细胞的鉴定和基因修饰小鼠制备等生命科学研究提供更为便捷、有效的技术平台。方法通过显微注射将10～15个G1-ESCs注入到野生型ICR小鼠的8细胞胚胎，转至KSOM+AA培养液滴中体外培养48h后置荧光显微镜下观察，计数囊胚率、胚胎干细胞嵌合体囊胚率和胚胎干细胞纯合子囊胚率。部分显微注射后的8-细胞胚胎置KSOM+AA培养液滴中体外培养2h后移植至假孕0.5d的野生型ICR雌鼠的输卵管内或者培养过夜后移植至假孕2.5d的野生型ICR雌鼠的子宫内。产出小鼠后蓝光激发下观察，全身均为绿色荧光且毛色为黑色的初步判断为ESC小鼠。将ESC小鼠与野生型ICR小鼠交配，根据其后代（F1）荧光观察及毛色判定ESC小鼠是否为生殖腺传递。解剖ESC小鼠，观察各器官荧光状况判断其全身器官是否均为胚胎干细胞细胞发育而来最终确定其是否为F0-ESC小鼠。结果（1）显微注射后体外培养至囊胚，荧光显微镜检查表明18.54%的囊胚内细胞团完全由G1-ESC形成；（2）培育出3只原代含有G1-ESC的小鼠，其中1只为F0-ESC小鼠（雄性），2只嵌合体小鼠；（3）将F0-ESC小鼠与野生型ICR雌鼠交配证实其为生殖腺传递；（4）F0-ESC小鼠各器官取材荧光观察发现各器官均有荧光证实其为全身均为ES细胞发育而来的F0-ESC小鼠。结论Velocimouse技术能有效的获得原代胚胎干细胞小鼠，为胚胎干细胞、诱导多能干细胞的鉴定和基因修饰小鼠制备等生命科学研究提供了更为便捷、有效的方法。本实验室建立的G1-ESC为具有可靠多能性的优良胚胎干细胞株。关键词Velocimouse技术基因修饰小鼠胚胎干细胞诱导性多能干细胞4Cultivationofprimarymicefullyderivedfromembryonicstemcells(F0-ESCmouse)anditsmethodologyAbstractObjective:ToproduceprimaryESCmice(F0-ESCmice)whichfullyderivedfromembryon