基因工程-第二章　基因工程酶学基础.ppt

第二章 基因工程的酶学基础 基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心的一系列步骤，需要多种具有不同功能的工具酶参与完成。以限制性内切酶(restrictionendonuclease)和DNA连接酶(1igase)为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应。已经知道有许多种重要的核酸酶，例如核酸内切酶、核酸外切酶，以及用信使RNA模板合成互补链DNA的反转录酶(reversetranscriptase)等，在基因克隆的实验中都有着广泛的用途 常用的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2 300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 限制性内切酶的发现 早在20世纪50年代初两个研究小组差不多同时发现，两种不同来源的λ噬菌体(λK 和λ B ）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞(K株和B株)，但当它们分别与其他宿主菌交叉混合培养时，则感染频率普遍下降数千倍。一旦λ K噬菌体在B株中感染成功由B株繁殖出的λ K后代在第二轮接种中便能保λ B一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。这种现象称为宿主细胞的限制和修饰作用，它广泛存在于原核细菌中。 1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。 寄主控制的限制与修饰 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 它们均由三个连续基因位点所控制：hsd R, hsd M,? hsd S hsd R---限制性内切酶:能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断 hsd M---限制性甲基化酶 :催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应 hsd S---控制两个系统的表达 :协助上述两种酶识别特殊的作用位点 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，存在两方面的作用： 保护自身DNA不受限制； 破坏外源DNA，使之迅速降解。 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：HindⅡ Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。 功能：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键，由此产生特定的酶切位点 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名： EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) 限制性内切酶II识别和切割位点 具有180度旋转对称回文结构 4～8bp；对称轴位于第三、第四碱基之间，有些识别位点是连续的，有些则是间断的，如GANTC；绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA。 出现两种末端 粘性末端 粘端 ：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平头末端 平端 ：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 粘性末端与平头末端 表3-3? 核酸内切限制酶的类型及其主要特性 同裂酶 (isoschizomers)： 有些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶 同尾酶(isocaudamer) ：虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。 影响限制性内切酶活性的因素 1、DNA的纯度 2、DNA的甲基化程度 3、酶切反应的温度 4、DNA的分子结构 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液 DNA的纯度 为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应