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NT-3介导的早期神经干细胞分化的信号通道 韩国首尔国立大学 Biochemical and biophysical research communications IF：2.494 一、研究背景 在脊椎动物的神经系统发生过程中，神经元的分化是神经细胞形成必须的。神经元的分化是从胞外信号激活膜受体开始的。然后这些受体通过激活胞外信号级联放大导致质膜动力学改变、细胞骨架重组和基因转录，这是神经元分化必须的。 * 2、神经营养素可调整许多神经元发展的进程。最近研究显示，脑源性神经营养因子（BDNF）在突触发生和突触可塑性上起作用。在相关的神经营养素中，NT-3因其广泛的作用而引起强烈的研究兴趣。NT-3是神经元存活、功能神经元分化的一个重要调节者。 * 3、神经元分化的分子机制已经成为研究的重点，若干研究已证明由神经营养因子引起的P44/42胞外信号调节激酶（ERK1/2）的激活可以触发细胞生长或者分化。 4、同样，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路在刺激神经元的存活和调节神经突生长、Trk的细胞内摄和逆向运输起重要作用。 * 信号通途 PI3K/Akt Signaling Pathway 活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能 * MAPK(促分裂素原活化蛋白激酶),属于一种Ser/Thr蛋白激酶. MAPK链由3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成,通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子. MAPKs被激活后可停留在胞质中，激活一系列其它蛋白激酶，使细胞骨架成分磷酸化，亦可经核转位进入细胞核激活各自的核内转录因子，再调节转录因子的靶基因如即刻早期基因、后期效应基因和热休克蛋白基因的表达，促进有关蛋白质的合成和通道改变，完成对细胞外刺激的反应。 ①ERK信号通路：胞外信号调节激酶 ②JNK/SAPK信号通路：cJun氨基末端激酶, /应激活化蛋白激酶 ③p38 MAPK信号通路 * 二、科学问题的提出 问题： 1.NT-3是否参与NSCs向神经元分化的早期活动？ 2.特异机制？ 3.此过程中神经突生长的情况？ * 三、实验设计大纲 实验材料：小鼠（E12.5） 细胞预处理： 取出胚胎 的前脑皮质，在含2%B27的DMEM/F12无血清培养液(碱性成纤维细胞生长因子+ 表皮细胞生长因子各 10 μg/L+100mg/ml青-链-新抗生素)的75ml培养瓶中培养5d，将细胞分离，转移到24孔板中。 分组： 对照组：在DMEM/F12无血清培养液培养 实验组：在加入NT-3的DMEM/F12无血清培养液培养 实验方法： 免疫细胞化学 神经突生长的测量：微孔过滤器，测量神经突蛋白的OD值 RT-PCR Western blotting * 实验结果 神经营养因子诱导干细胞的 自我更新(A)按先前描述的方法处在EGF和bFGF平展培养的细胞。巢蛋白抗体染色细胞（干细胞的标志物）比例100um 20ng/mlNT-3培养皮质细胞2,4，8d (B)免疫染色MAP2用20ng/ml培养皮质细胞2,4，8d (C)Western-blot显示MAP2在2d时被NT-3激活，而NT-3 和对照组在4d和8d时MAP2的表达量没有改变。 * NT-3以剂量依赖性方式诱导神经元分化和神经突生长 首先将NSCs在无NT-3下培养1d，然后在NT-3梯度下培养2d （A）免疫组织化学分析4d时NSCs中的MAP2.每个数据 (B)Western-blot分析MAP2 *用在图中所用的条件下培养细胞，然后对神经突的生长进行测量，可到类似的结果，NT-3以剂量依赖性的方式诱导神经突的生长。 为了进一步确定NT-3的作用方式 (C)皮质神经元总RNA进行RT-PCR.PCR产物用逆转录酶的作用下表明转录。用β-actin作为参照。 * NT-3以时间依赖性的方式诱导神经元分化 对实验组和对照组的NSCs按时间梯度分别培养 (A)神经元的分化证明是以时间依赖性方式 （B）NT-3以时间依赖性方式作用于神经干细胞。在细胞提取物中用Western-blot分析MAP2和GFAP *用在图中所用的条件下培养细胞，然后对神经突的生长进行测量，可到类似的结果，NT-3以时间依赖性的方式诱导神经突的生长。. * 为了研究机制，选择了三条信号通路 (A)以时间依赖性的方式用NT-3处理的NSCs,用Western-blot分析P-Akt，P-ERK和P-P38.用β-actin作用内参。 为了进一步确定，向实验组中加入抑制剂 （B）用Western-blot分析以确定抑制物LY294002，PD98059和SB202190,作用的有效性和特异性。实验组