加减清营汤对H2 02损伤血管内皮细胞存活率和SOD活力影响.docVIP

加减清营汤对H2 02损伤血管内皮细胞存活率和SOD活力影响 　　摘要：目的：观察加减清营汤对H202损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响。方法：体外培养内皮细胞ECV304，用3801xmol／L H2o2损伤细胞，随机分成正常组、模型组、血清对照组、丹参组、加减清营汤含药血清组。用血清药理学方法给药，继续培养后应用MIT法观察细胞存活率，检测SOD。结果表明：加减清营汤含药血清组MTT的OD值在24h点高于H202模型组(P0.05)，36h后与血清对照组有明显差异(P2O2对ECV。的损伤程度，其机理可能与抗氧化作用有关。 　　关键词：加减清营汤；血栓闭塞性脉管炎；H202；血管内皮细胞；MTT；SOD 　　中图分类号：R285.5 　　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)01－0141－03 　　 　　血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医学“脱疽”范畴，是一种常见的周围血管疾病，其发病率居周围血管病的第2位，多见于青壮年男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实，实验研究亦观察到该方的作用机理与改善血液流变学状态、降低全血黏度和血浆黏度、抑制血小板聚集功能、改善血液循环状态有关。为深入探讨该方治疗TAO的机制，本实验采用体外细胞培养方法，用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型，研究加减清营汤对内皮细胞存活率和SOD活力的影响。现将结果报道如下。 　　 　　1　实验材料 　　 　　1.1　细胞药物及试剂人脐静脉血管内皮细胞株(EcV304)：购自中国科学院上海生物化学研究所，中国科学院典型培养物保藏委员会。加减清营汤：全方由丹参、赤芍、生地、金银花、连翘、毛冬青等组成，制成100％煎剂(即lmL／lg生药)，药物由本校国医堂门诊部药房提供，符合2005版药典要求。 　　丹参注射液：江苏神龙药业有限公司生产，批号：0506143。RPIM－1640培养粉：GIBCO，USA，批号：2535081。小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，批号：040603。胰蛋白酶：Typrin，1：250，Amerso，USA，批号：0428S05。四甲基偶氮唑盐：NTr，Bioshorp，批号：G793。二甲基亚砜：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：050718。超氧化物歧化酶(sOD)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号30％过氧化氢：H2o2，分析纯，上海久忆化学试剂有限公司，批 　　 　　1.2　动物　SD雄性大鼠8只，体重(280±20)g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK2003－0003。 　　 　　1.3　仪器5％Co2培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(Olympus，Japan)；酶联免疫检测仪(BIO－RAD，USA)。 　　 　　2　实验方法 　　 　　2.1　药物血清的制备加减清营汤水煎剂以人临床用量×动物等效剂量比值×血清稀释度为参考浓度给给大鼠连续灌胃3天，每天2次，正常对照组给予等量蒸馏水。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h)，颈动脉取血。以1000r／min离心15mln，分离血清，然后56℃ 30mln灭活以除去补体，再用0.22ttm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于－20℃冰箱保存备用。 　　 　　2.2　细胞培养用传代人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)作细胞培养，按照常规方法复苏，将收获细胞用培养液悬浮后，种植于培养瓶内，置37℃ 5％co2培养箱内培养2天，待细胞生长至80％融合时，用于实验。 　　 　　2.3　分组与处理将呈对数生长期的ECv304以105／cm2的密度接种于96孔板，分为5组，待细胞长至融合后，除正常组外，其余各组在造模前均用不含血清的培养液以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。即：(1)正常组。含10％小牛血清的培养液；(2)模型组：加H2O2(终浓度为380ttmol／L)、不含血清的培养液；(3)血清对照组：加H2O2(终浓度为380ttmol／L)、含10％正常大鼠血清的培养液；(4)丹参组：加H2 02(终浓度为380；tmol／L)、含10％丹参注射液(终浓度为0.5g／L)的培养液；(5)加减清营汤含药血清组：加H2O2(终浓度为380umol／L)、含10％加减清营汤药物血清的培养液；操作完成后，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、36h。　 　2.4 MTF法测定细胞活性往96孔板加入5mg／mL浓度的MTr,37℃培养4h。再加入100UL DMSO震荡15min，待细胞线粒体代谢MTT所形成的甲(月?)充分溶解后，用酶联免疫检测仪按参比波长为490rim，测定各孔吸收OD值。