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幽门螺旋杆菌激活培养与保存条件 　　摘要：目的：探索激活幽门螺旋杆菌(HP)方法及保存条件，优化培养方案。方法：采用不同培养基进行培养，研究不同培养基对HP生长的影响；通过正交试验设计，优选幽门螺旋杆菌固体培养处方，并研究其菌种保存条件。结果：不同培养处方条件下幽门螺旋杆菌生长情况存在显著差异。结论：寻找到了HP比较满意的复苏、培养、保存条件。 　　关键词：蜂胶左金胃三联；幽门螺旋杆菌；激活；实验研究 　　中图分类号：K37　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1851－03 　　 　　幽门螺旋杆菌(HP)是一种弯曲状的革兰氏阴性杆菌，与消化疾病的关系现已被国内外大量研究所证明：HP是胃炎、消化性溃疡的最主要致病因素。如何根除HP所致的消化系统疾病已成为消化界学者关注的热点。为了完成基金项目蜂胶左金胃三联抗幽门螺旋杆菌临床与实验研究，首先遇到的是HP的培养保存的问题，由于HP的生物特性所决定其生长条件要求非常高，培养过程十分复杂、杂菌生长多，给研究HP带来很大困难，本文主要研究了不同培养基条件对HP生长的影响，探讨并优选出最佳的培养条件，保存方法，为下一步蜂胶左金胃三联抗HP的体外抑菌实验、血清药理实验、药敏等试验做好前期准备。 　　 　　1　材　料 　　 　　微需氧培养罐(昆明玻璃厂制)、恒温培养箱、超净化工作台、混合气体(85％N2、10％CO2、5％O2)(昆明天贝特种气体有限公司)、温度湿度表(天津风洋仪器仪表工贸公司)、幽门螺旋杆菌菌株(北京疾控中心)、哥伦比亚琼脂、脑心浸液琼脂(中国进出口商品检验技术研究所、北京陆桥技术有限责任公司)、万古霉素(批号0319，BieSharp公司)、多粘霉素(批号0990，BioSharp公司)、两性霉素(批号E437，XIASI BIO公司)、甲氧氨苄嘧啶(批号06121.RESEARCH ORGANICS公司)乳酸(上海试剂一厂)、氧化酶、尿素酶(杭州天和微生物试剂有限公司)、新生牛血清、羊血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、羊全血(昆明医学院动物中心)。 　　 　　2　方　法 　　 　　2．1 混合抗生素的配制 　　精密称取万古霉素0.016g，两性霉素B 0.016g，多粘菌素0.0006g，将此3种抗生素在紫外线下照射1 h，均匀混合。精密称取甲氧苄胺嘧啶0.008g，溶于10mL蒸馏水，并加乳酸一滴，煮沸10min，之后无菌加入以上混合抗生素中，用灭菌蒸馏水加至40mL，混匀，4℃保存备用。 　　2．2　固体培养基的配制 　　2．2．1　正交试验法筛选固体培养基条件　选用混合因素正交表进行实验，以血样、琼脂、混合抗生素、pH值为考察因素，以综合评分为考察指标。 　　2．2．2　按照因素水平表配制固体培养基　量取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊全血0.8mL，调pH值为7.5，混合均匀后快速浇板备用。量取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值为8.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL，调pH值为8.5，混合均匀后快速浇板备用。取脑心浸液琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊全血0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值为8.5混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调到7.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时入羊全血0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调到6.5，混合均匀后快速浇板备用。从4号三角瓶中量取脑心浸液琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊血清0.8mL，调pH值调到6.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调到6.5，混合均匀后快速浇板备用。取脑心浸液琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调到7.5，混合均匀后快速浇板备用。 　　2．3　HP培养 　　将固体培养基制备好后，用L棒在上述各固体培养基上涂菌液，放入培养罐中，充气10min，温度37℃，湿度90％以上，培养72h。 　　 　　3　HP鉴定实验 　　 　　3．1　菌落形态 　　培养器皿平板上的HP菌落呈针尖样，毛玻璃样半透明湿润。 　　3．2　涂片镜检 　　方法：用生理盐水1滴，滴在干净载玻片上，用接种环刮取少许HP菌落在生理盐水中并涂开。将涂片烘干后进行常规革兰染色，在显微镜下观察，见紫红色短杆状。 　　3．3　氧化