微生物生理生化反应及药物抗菌实验.pptVIP

实验三 微生物的生理生化反应及药物抗菌实验 P.220-225 一、生理生化反应1. 实验目的 初步了解微生物生化鉴定与分类的原理与方法；掌握淀粉水解试验、明胶水解试验、尿素水解试验（脲酶试验）、糖发酵试验、硫化氢产生试验的原理和方法。 2. 原理 1.）某些细菌能够分泌一种胞外酶,即淀粉酶。它可将淀粉水解为小分子的糊精、麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。 淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能产淀粉酶的微生物在含淀粉培养基上培养后，由于淀粉被细菌的淀粉酶水解，遇碘不再变蓝色，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 2） 许多细菌含有脲酶，尿素酶能将培养基中尿素分解成氨、二氧化碳和水，产生的氨累积在培养基中，使加有酚红酸碱指示剂的营养琼脂由中性变成碱性，从而产生颜色变化（由黄色变成深粉红色）。通过生化管的颜色变化就可以判断接种的培养基是否产生尿素酶。(注:在空气中放置一段时间后上部变红,原因空气氧化) 3）有些微生物能够分解葡萄糖或乳糖产生有机酸（乳酸、醋酸、丙酸）使生化管的pH值降低，从而使含酸碱指示剂溴甲酚紫（pH5黄－pH7紫）的营养琼脂由紫色变成黄色，通过生化管的颜色变化可以判断是否能产生相应的糖水解酶类。 4）有些微生物能够分解含硫氨基酸（甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸）产生硫化氢，遇生化管中的铅盐或铁盐形成黑色硫化铅或硫化铁。 5）明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。如果接种的微生物能够产生明胶酶，它可将明胶水解成小分子物质，破坏其交替状态，使明胶生化管在25 ℃以下发生液化，据此性质可以鉴别产明胶酶的微生物。 3. 实验步骤 1）淀粉水解实验：每4人接种2支淀粉生化管（分别接种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌），37℃培养1d，加卢革氏碘液少量观察和记录每管颜色变化，得出结论。 枯草芽孢杆菌是阳性对照菌。 2）乳糖发酵试验：每人接种二支乳糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37℃培养1天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。 大肠杆菌是阳性对照菌。 3）尿素水解实验：每4人接种2支尿素生化管（分别接种变形杆菌和金黄色葡萄球菌），37℃培养1天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。 变形杆菌是阳性对照菌。 4）葡萄糖发酵试验：每4人接种2支葡萄糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37℃培养1天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。 大肠杆菌是阳性对照菌。 5）硫化氢产生试验：每4人接种2支硫化氢生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37℃培养1天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。 变形杆菌是阳性对照。 6）明胶水解实验：每2人接种二支明胶生化管（分别接种枯草杆菌和金黄色葡萄球菌），37℃培养2天，从37℃取出即观察和记录各管的明胶水解情况，得出结论。 枯草杆菌是阳性对照菌。 4. 实验注意事项 淀粉水解实验，在观察时需要加卢革氏碘液以便观察淀粉的水解情况； 生化管用砂轮切割玻璃后接种。 二、 微生物抗药性实验（不做） ----抗药性突变株的分离 1、实验目的 掌握微生物变异的原理 了解紫外线诱变筛选突变菌株的方法 学习用梯度平板法分离抗药性突变株 2.实验原理 基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。 1、自发突变---（抗药性突变） 1）基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。 2）微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是引发突变的诱导物。 3）因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上生成菌落。 4）将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。 5）抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是非常重要的。 6）为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗氨苄青霉素突变株。 2、紫外线诱发突变 紫外线是一种常用的物理诱变因素，主要作用于DNA，引起DNA损伤； 为避免光修复，处理后的微生物应放暗处培养。 3、实验步骤 1）抗药性菌株的筛选(p.167) （1）取一个已经灭菌的空大平皿，把培养皿斜放(一边垫起)，在无菌条件下倒入不含药物的底层培养基（10mL LB培养基,已分装好，每一试管10mL,保温在灭菌锅中，要快）； (在实验室做) （2）待平板中的培养基凝固后将平皿