CRF01-AE亚型HIV-1感染的MSM患者病毒特异性CTL应答与病毒控制水平关系的研究.pdfVIP

中文论著摘要． CRF01 CTL应答与病毒控制水平关系的研究 目的 艾滋病是一种严重危害人类生命健康的致死性慢性传染病，虽然至今还没有 有效的疫苗，但大量研究证实CDS+T细胞介导的CTL应答在疾病的控制过程中 起了重要作用。急性期CTL应答的出现伴随着病毒载量的明显下降，并在很大程 sexwithmen． 度上决定着病毒调定点水平的高低。近年来，男男同性(menwhohave MSM)传播方式增长迅速，同时基于人群水平的分子流行病学研究表明，在中国 MSM感染者中CRF01～AE亚型已经成为主要流行亚型。虽然关于欧美及高加索 人群中流行的B、C亚型病毒的CTL应答已经有了广泛而深入的研究，但不同病 毒亚型及不同感染人群CTL应答特征及控制疾病的方式不尽相同，中国男同人群 中CRF01 AE亚型CTL应答特征及控制疾病的方式尚不清楚，针对我国男同人群 CTL疫苗的研究仍缺乏基础资料的支持，因此急需对这部分人群进行急性期CTL 应答的研究，以明确中国男同人群中CRF01AE亚型CTL应答特征，同时探索与 疾病控制相关的因素。 我们在前期研究的基础上设计合成了CRF01 AE亚型传播簇特异性的Gag、 Pol、Nef区段的重叠肽段及部分HLA型别限制的最佳表位，对15例CRF01AE 亚型HIV-1急性感染者进行动态CTL应答的研究，同时获得了动态Gag克隆序列， 我们发现在CRF01一AE亚型的MSM感染者中，针对Gag区段表位产生持续的免 疫显性应答可以有效控制病毒，为基于中国CRF01 AE亚型MSM患者的疫苗设 计提供了理论基础。 材料和方法 1、研究对象 从2008年开始对辽宁大规模MSM高危人群队列进行定期随访并进行血清学 ELISA筛查实验和WestemBlot确认实验，对血清学阴性者进行集合核酸检测， 满足以下一项或多项者：1)在3个月内HIv抗体开始变阳性者；2)HIV抗体阴 性但HⅣRNA阳性者；3)HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前 次升高者；4)WB抗体检测少于4条蛋白条带者，认定为新发感染者。HIV新发 感染者感染时间的估计方法为：患者核酸检测阳性前14天作为HIV感染时间， 初筛阳性患者以此次阳性与末次阴性的中间时间作为HIV感染时间，有可靠高危 性行为史的患者结合高危行为史判定。本研究共对15例新发感染者感染3个月点 和1年点PBMC和血浆样本进行纵向研究。 2、肽段合成 根据前期获得的50余条辽宁新发CRF01AE亚型第二簇的全长序列，利用 BioEdit软件合成共享氨基酸序列，然后用HIV Database中PeptGenPeptide 叠肽段，合成CRF01 的己发表的最佳表位，及具有明确保护性作用的B27限制的KKl0表位，所有表 位均按照CRF01AE亚型中序列进行合成。 3、Elispot肽库筛查及单肽确认 采用14x16的二维矩阵肽库对Gag、Pol、Nef区段肽段进行筛查，肽段反应 SFC／106 终浓度为599／ml，每孔加入0．Imillion细胞。阳性判断标准为：大于50 PBMC同时大于3倍阴性对照平均值。同时将筛查的肽库进行拆解，进行单肽确 认实验。实验操作同上述ELISPOT筛查实验。反应结果的计算及阳性判断标准也 与筛查实验相同。 4、Elispot最佳表位实验 将相应HLA型别限制的最佳表位进行Elispot实验，实验操作同上述筛查实验。 反应结果的计算及阳性判断标准也与筛查实验相同。 5、DNA提取 外周血DNA的提取，使用lml DNAMini EDTA抗凝外周静脉血，采用QIAamp 试剂盒，按照试