Modified+Cry3A+α同源基因转化杨树湘林系列无性系的研究.pdfVIP

摘 要 本研究以杨树湘林系列无性系(XL．80、XL．77和XL．90)叶片为材料，在建 立高效组培再生体系的基础上，采用农杆菌介导法，开展了Modified Cry3Aa同 2撑的遗传转化研究，取得的主要进展如下： 源基囚Cry3Aal拌和Cry3Aa 1．湘林系列无性系叶片高频组培再生体系的建立 (1)XL．80最佳不定芽诱导分化培养基为MS+I．0 mg·L～6．BA+0．1mg·L。1 6-BA+0．1 mg·L～NAA+0．2mg·L～GA3，增殖系数为5．8；最佳生根培养基为 1／2MS+0．3 mg·L～NAA，生根率为100％，根系质量最好，幼苗生长健壮。 mg·L‘1NAA (2)XL．77最适诱导分化培养基为MS+I．0mg·L～6．BA+0．15 +0．005 mg·L～6．BA mg·L—TDZ，诱导率达95．8％；最佳伸长培养基为MS-I-0．5 +0．2 约3．5---6．5cm，叶细长，叶色深绿。 oLqNAA+ (3)XL．90最适诱导分化培养基为MS+0．5mgoL～6一BA+0．1mg 0．01mg·L—TDZ，诱导率达96．3％；最佳增殖培养基为MS+0．2 mg·L～6．BA +o．1mg·L—NAA，增殖系数达到7．4，无菌苗生长健壮；最佳生根培养基为 I／2MS+2．0 mg·L—IBA，生根率达100％，根系较粗，侧根明显，幼苗生长健壮。 2．湘林．77、湘林．90遗传转化中选择压的确定 筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶(Nptll)基因，遗传转化中采用Km作为 筛选转化植株的选择剂。经对比试验结果表明：XL．77分化培养基添加 20mg·L～Km、生根阶段添加浓度为30mg·L～Km较为合适。 3．湘林．77、湘林．90遗传转化体系的优化 采用导入pBll21．2k质粒的农杆菌菌液转化XL．77、XL．90叶片，研究单因素 对农杆菌转化效果的影响。结果表明，转化Cry3Aal撑基因的最优条件为预培养 2撑基因的最优条件为预 3d、侵染20min、共培养4d、AS不需添加；转化Cry3Aa 培养3d、侵染20min、共培养3d、AS浓度为160umol·L～。 4．湘林．77、湘林．90转抗虫基因植株的获得和分子检测 l撑基因Km’抗性芽、 在经Km严格筛选获得转化XL一77的共有14株含Cry3Aa l撑基因Km‘抗 7株含Cry3Aa2拌基因Km。抗性芽；转化XL-90共有5株含Cry3Aa 2撑基因Kmr抗性芽。对再生植株进行PCR检测，结果共筛选 性芽、3株含Cry3Aa 2拌基因Km7抗性 6株(XL．77：2株转Cry3Aal撑基因Kmr抗性芽，l株转Cry3Aa 2撑基因Kmr抗性芽) 芽；XL．90-l株转Cry3AaI撑基因Km。抗性芽，l株转Cry3Aa PCR呈阳性植株，占20．7％。实验结果初步证明目的基因已被导入XL-77、XL．90 杂种基因组中。 关键词：杨树：无性系；农杆菌介导法；杀虫晶体蛋白基因