分子信标荧光探针用于核酸毗邻过程的实时监测及病毒RNA的检测.pdfVIP

中文摘要 核羧是生命体累中的关键物赝，它承载惹传递遗传信息、编码其它捆关生物 分子的重要任务，在分子生物学并玎生物技术领域受到广泛关注，是发展非常迅速 的研究重点。核酸稠关生命功能的完成需要蛋岛质(酶)酶狒蠢参与。对核酸和 甥关蛋自豹樱互{乍爝研究正是以功能綦因组和蛋白艨组的研究为挺志的后基因 组时代所关注的热点之一。 梭酸的转荥、修复和嚣缝是细胞生命周麓审的重黉过程，由棱酸连接簿催纯 约核酸连接反应是这些过穰孛不可或缺的步骤，传统灼核酸连接分析的硪究手段 主要是凝胶电泳技术，无法满足实时监测核酸连接过程的要求，限制了人们对于 这一{乍用过稔更为篡体和报本的梳理的深入了解。有关核酸与连接酶作丽的实辩 过程镀息戆获褥撬不仅毒助手对一些生命过稳援理懿磅究，还将兔瓶药斡设诗提 供新的技术手段，为疾病的治疗找到新的方法。 病毒基因组RNA的快速检测对于由RNA病毒感染的疾病诊断与防治其有鬣 要意义。星翦普遍遨蠲豹RT-PCR方法对于摸缀豹掇缝毒较褒豹蘩菠，于是，敷 展简便、快速而灵敏的技术用于病毒RNA的检出变得尤为重要。 是在褰聚垓薮羧搽镑熬基穗上发震起象懿一类具毒蒸一环殡构款寡蒙核营酸擎 链探针，具有高灵敏度、高特异性和背景值极低，无需分离未杂交探针等优点， 不仅通用予核酸分析，而髓同样也适用于蛋自质(酶)等能与核酸发生相互作用 蕊魏矮分辑，免实瓣整测辫壹矮(酶)譬核酸佟援麴避程提供了极磐豹鼓零手段。 本实验室唐志文博士；fjl|用分子信标核酸探钎，发挥其研究棱酸及相关蛋白旗 (酶)豹优势，剑毅姓地嚣曩黯梭酸连接、核羧磷酸纯以及核黢酶切过稷豹实射 监测研究，本论文作为唐虑文博士论文工作的一部分，从分子信标实时监测核泼 与蛋囱质(酶)的作用过稳和分子信标侠捷地检测瘸海RNA两个角度开展研究， 发袋了基予分子售标夔鬏戆检测技本秘痘甥磷究傣系，可从分子水平上获取生貔 大分子之间相互作用的动态信息： (I)利用分予信标蜜时膝测了14DNA逐接酶催他的DNA涟接过程，并建 立与蜜嚣反疲体系稿痤鹣动力学模型。 l 建立了一种新的核酸连接实时监测方法，利用分子信标作为核酸连接反应的 DNA模板和检测分子，在核酸分子连接的同时检测荧光信号。首次实时、准确 地获取核酸连接过程信息，为核酸连接酶分析、核酸连接动力学过程研究提供全 瓶、有效的手段，也为深入研究核酸连接酶与核酸分子间的相互作用提供了新的 思路与技术。与传统的研究方法相比，该方法避免了放射性同位素标记、变性凝 胶电泳、放射性自显影等复杂的操作，为核酸连接过程研究提供一种新的非同位 素分析方法，并建立了该方法的动力学模型，将有助于我们进一步揭示核酸与蛋 白质这两种生命中最关键物质之间的相互作用与关系。在此基础上建立了快速、 U／mL。 准确检测T4DNA连接酶的分析方法。其检测下限为2．3×10‘4 (2)基于分子信标实时监测大肠杆菌DNA连接酶催化DNA连接的活性， 并建立了高灵敏地分析连接酶活性的方法。 DNA连接酶相似，以ATP为辅酶的之外，另一 核酸连接酶除了一类与T4 类以NAD+为辅酶的连接酶也具有同要重要的研究价值。因此，在上一章建立的 研究T4DNA连接酶的技术的基础之上，本章进一步发展了对以NAD+为辅酶的 Ecoli DNA连接酶的活性及其催化的DNA连接过程的实时监测方法。 coli 该方法灵敏、实时地监测了E DNA连接酶催化的DNA连接反应的进 coli 程。建立了快速、准确检测E DNA连接酶的分析方法，检测下限为4．0×10。4 U／ml。与传统的研究方法相比，该方法既避免了同位素标记、变性凝胶电泳、放 射自显影等复杂的操作，又为深入研究核酸连接酶与核酸的相互作用提供了实 时、丰富的动力学数据，为蛋白质(酶)与核酸的相互作用研究提供了新的思路、 方法和有效的手段，对于推动其动力学过程的深入研究具有重要的意义。 (3)基于分子信标荧光探针快速检测烟草花叶病毒的新方法研究 mo