基于血清蛋白质组学日本血吸虫病诊断标志物的筛选及其免疫应答的研究-screening of diagnostic markers for schistosomiasis japonica based on serum proteomics and study on its immune response.docxVIP

利用血清蛋白质组学方法从日本血吸虫成虫中筛选出 30 多个具有免疫反应性的蛋白点，其中有 10 阳性点能够与同源的 2-DE 凝胶明确匹配，质谱测序结 果显示，这 10 个点对应 4 种不同的蛋白质，它们分别是亮氨酸氨基肽酶（SjLAP）、 果糖二磷酸醛缩酶（SjFBPA）、26kDa 谷胱甘肽转移酶（SjGST）和 22.6kDa 血 吸虫表膜主要蛋白（Sj22.6），进一步成功表达出了重组的 SjLAP（rSjLAP）和 SjFBPA（rSjFBPA），纯化后的 rSjLAP 和 rSjFBPA 的蛋白浓度分别高达 5mg/ml 和 4mg/ml；诊断评估中的 ELISA 结果显示，rSjLAP 对急性和慢性血吸虫病的敏 感性分别达到了 98.1%和 87.8%，rSjFBPA 对急性和慢性血吸虫病的敏感性也分 别达到了 100%和 84.7%，而两个重组抗原的诊断特异性都达到了 96.7%，在治 疗后不到 6 个月时，急慢性血吸虫病患者血清中的两种重组抗原的抗体滴度都发 生有意义的下降（P0.001），在 6-12 个月时，有 80%患者血清中抗体恢复到正 常人水平。rSjLAP 和 rSjFBPA 抗原分别免疫 BALB/c 小鼠，2w 后小鼠血清中的特异性 IgG 抗体迅速升高，至初次免疫后 6w 达到峰值，与特异性 IgG 抗体结果一致的 是，两种抗原免疫后的小鼠血清中特异性 IgG1 也明显升高，达 6w 后维持在较 高水平，而血清中的特异性 IgG2a 在免疫后 8w 均没有发生明显变化。与对照组 相比，刺激后的脾细胞培养上清 ELISA 结果显示，IL-4 和 IL-10 细胞因子明显 升高，而 INF-γ 和 IL-2 没有发生变化；Real-time PCR 结果显示，GATA-3、IL-4 和 IL-10 表达水平也显著升高，而 T-bet、INF-γ 和 IL-2 则不然。结论利用血清蛋白质组学技术成功地从日本血吸虫成虫中筛选出了 SjLAP 和 SjFBPA，并成功克隆和重组了 rSjLAP 和 rSjFBPA；研究结果证明，rSjLAP 和 rSjFBPA 是两个有用的血吸虫感染诊断候选分子，rSjLAP 和 rSjFBPA 抗原分别 免疫 BALB/c 小鼠后，宿主发生强烈的 Th2 型免疫优势应答。同时也证明，血清 蛋白质组学方法是筛选疾病诊断候选分子的强有力手段，是切实可行的。该研究 为血吸虫病诊断试剂、疫苗的开发奠定了理论基础。关键词：蛋白质组学 诊断 免疫反应 血吸虫病Serological proteome-oriented screening of antigens for the diagnosis of Schistosomiasis japonica and host immune response to these antigensPH.D candidate: Zhengrong Zhong Supervisor：Prof. Jilong ShenAbstractObjectiveSchistosomiasis remains a major parasitic disease, with 200 million people infected and 779 million people at risk worldwide. Lack of effective vaccines and reliable diagnostic techniques makes this disease difficult to control. In an attempt to discover useful candidates for the diagnosis of schistosomiasis, proteomics in combination with western blotting were employed in this study. Furthermore, the host immune responses to these candidates were studied.MethodsFollowing two dimensional electrophoresis (2-DE), the adult worm fractions were transfered onto NC membrane for Western-blot analysis. The developed films were aligned and then matched with the homologous Coomassie brilliant blue (CBB)-stained