活化的凝血因子X(FXa)和凝血酶(Thrombin)的他离制备和相关物性质的研究.pdf

主堕型堂垫查奎堂竖主堂焦堕苎—— ／、，一／一 蚁9) 摘要 f，血液中存在着许多种酶都是人们非常感兴趣的，凝血系统中的酶 ＼ 是这些研究热点中的两个有代表性的酶，二者在凝血瀑布反应中起着 重要的作用，二者的高效抑制剂也成为现在抗凝血、抗血栓药物研究 和应用的重点目标。二者目前用于融合蛋白特异内切酶最为普遍，国 内自主技术开发这两种酶，会大大推动以融合蛋白表达的生物工程的 发展，并预期在中国会有较好的应用前景a本研究利用离心、离子交 气——7 换色谱等现代分离手段和分析方法，从牛血采集开始，利用离心技术 分离得到血浆；根据钡盐吸附维生素K依赖的凝血因子的性质。研 究了硫酸钡和柠檬酸钡两种钡盐沉淀吸附蛋白的效果，柠檬酸钡沉淀 吸附效果较好；改进了柠檬酸钡沉淀上的蛋白洗脱方法，直接将柠檬 酸钡沉淀加入到30％饱和度硫酸铵溶液进行沉淀转化；再利用硫酸铵 沉淀蛋白分级技术得到凝血因子X(Fx)和凝血酶原等蛋白粗提物； S柱) Q柱、Resource 采用离子交换层析技术(Q—Sepharose柱、Mono 成功分离得到了FX和凝血酶原组分，并成功地活化和纯化了FXa、 凝血酶，获得了电泳纯的产品，并且解决了与该项分离、活化和纯化 路线相关的所有技术难点，建立了一种高效分离工艺路线。(利用快速 ＼ 蛋白液相层析技术一步从鲁氏蝰蛇毒素(Rw)中分离得到高纯度的 FX活化酶(RVV．x)，从Oxyuranus 到凝血酶原活化组分oS．Ⅱ。在活化凝血酶原时采用FXa和Os．II复合 技术，大大提高了凝血酶原的活化效率。L卫足 主 里型堂垫垄查堂竖主堂焦丝．苎一—— f茶作为一种饮料在世界范围被消费，饮茶可以预防包括肺癌和消 ＼ 化道癌的几种肿瘤的生长。为何饮茶具有如此功效，目前仍然不清楚。 本研究通过寻找活化的凝血因子X抑制剂，用高效液相色谱(HPLC) 方法从茶叶粗提物中分离出茶多酚，并研究了表没食子基儿茶素没食 p tJ,mol／L就有 的抑制效果，当浓度在O．5mol／L就有所体现，在5—10 很好的效果，随着浓度的增加，抑制效果逐步增强。EGCG具有抑制 FXa活性和抗肿瘤迁移的活性，我们提出一个抗肿瘤细胞迁移的假 想，即高效抑制活化的凝血因子x的抑制剂可能具有抗肿瘤迁移的 活性。这一假想不仅可以通过另外一个专一抑制FXa活性的蛋白 饮茶抗癌的机制。)一七』 凝血因子x被RVV．X活化可以通过两条路径：(1)FX--*FXB—Fx。 一—： B； 法对FX的活化进行了观察，结果证明中间态的FXa。比中间态的FX 。更稳定，也就是当降解肽被切割后，活化肽更容易从中问肽上脱除。 我们认为降解肽的功能可能是稳定凝血因子x的构象，其中的寡糖 链结构可能起着关键的作用。从我们的电泳图分析，发现在活化反应 的初期，凝血因子X的二条活化路径是彼此竞争的。 ，一—— f蛇毒是一类宝贵的资源，皖南尖吻蝮蛇蛇毒中的抗凝血因子 ＼ 中国科学技术大学博士学位论文 围内结构变化不大，钙离子不仅与ACF可逆结合，而且能够稳定ACF 的构象。用荧光光谱方法对NADase的性质也作了初步研究，结果表 光谱变化很大，表明Cu2+对维持NADase构象起重要作用。Lo， f稀土化合物是～个很好的抗凝剂，其特点是作用迅速，和直接作 用的抗凝剂如肝素相当，并且有效应的长期性，但是目前稀土的抗凝 的活性的影响，发现低浓度的Gd3+离子可以提高FXa的活性，高浓 度Gd3+离子能够抑制FXa。因此我们推测稀土化合物的抗凝机制可能 是低浓度的稀土离子可能与钙离子共同促进提高FXa的活性，但是 在高浓度时，稀土离子可能与FXa结合形成