姜黄素诱导ho1表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化损伤能力的实验研究-experimental study on curcumin-induced ho1 expression enhancing human umbilical vein endothelial progenitor cells activity and antioxidant damage ability.docxVIP

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2018-08-14 发布于上海
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姜黄素诱导ho1表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化损伤能力的实验研究-experimental study on curcumin-induced ho1 expression enhancing human umbilical vein endothelial progenitor cells activity and antioxidant damage ability

姜黄素诱导 HO-1 表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化损伤能力的实验研究摘要目的：体外分离、培养及鉴定人脐静脉血内皮祖细胞（EPCs）。探讨姜黄素(Curcumin, CMN)诱导 EPCs 表达血红素氧合酶-1 (Heme Oxygenase-1 , HO-1)增强自身细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。方法：实验研究分为四部分：1. 人脐静脉血 EPCs 的分离、培养、鉴定：采用密度梯度离心法分离、培养人脐静脉血 EPCs，通过倒置相差显微镜下观察 EPCs 形态学变化，免疫荧光法观察 EPCs 吸收 Dil-ac-LDL 和 FITC-UAE-1 情况并对 7d 的 EPCs 进行 CD133 免疫荧光鉴定。2. CMN 的细胞毒性作用及诱导 EPCs 表达 HO-1 的效果评价：将培养的 EPCs 分为 A、B、C、D 四组，分别以终浓度为 0、5、10、15μmol/L CMN 的培养基孵育 24h，CCK-8 检测各组细胞增殖活力、比色法检测各组培养液中 LDH 活力，分析 CMN 对 EPCs 是否具有细胞毒性作用。Western blot 检测各组细胞 HO-1 表达量，明确 CMN 诱导 EPCs 表达 HO-1 的作用以及选择后续实验所需 CMN 的最佳浓度。3. CMN 诱导 EPCs 表达 HO-1 的细胞内信号转导机制研究：将培养的 EPCs 分为 A、B、C 三组，分别在单纯培养基、终浓度 15μmol/L CMN 的培养基、终浓度 15μmol/L CMN+1μmol/L 全反式视磺酸（ATRA）的培养基中孵育 24h。Western blot 检测各组细胞 HO-1 表达量，探讨 CMN 诱导 EPCs 表达 HO-1 的信号机制。4. CMN 诱导 EPCs 表达 HO-1 增强自身细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制研究：将培养的 EPCs 分为 A、B、C、D 四组，分别在单纯培养基、终浓度 15μmol/L CMN 的培养基、终浓度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN的培养基、终浓度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN+10μmol/L 锌原卟啉（ZnPPIX）的培养基中孵育 24h。 CCK-8 检测各组细胞活力、比色法检测各组培养液中 LDH 活力、ELISA 法检测各组培养液中的血管内皮生长因子(VEGF)和人碱性成纤维生长因子（bFGF）活力、AnnexinV-FTTC/PI 双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。明确 CMN 增强 EPCs 活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。结果：1. 从脐静脉分离出来的单核细胞培养 3-4d 开始贴壁；7d 后有一定方向性，呈簇状生长；大约 9d 时出现多个血岛样细胞团。表面标记 CDl33 免疫荧光检测显示绿色阳性率90％，免疫荧光鉴定显示90％的贴壁细胞呈双荧光染色阳性。2. 以终浓度分别为 0、5、10、15μmol/L 的 CMN 孵育的各组 EPCs，细胞增殖活力分别为（0.743±0.250)、（0.810±0.135）、（0.854± 0.374）、（0.895±0.193），组间比较有显著差异（P0.05），表明 EPCs 的增殖活力随 CMN 浓度的升高而明显升高； LDH 活力分别为（732.4±45.2）、（728.1±35.8）、（745.7±48.6）、（750.2±47.3），组间比较无差异（P0.05），表明 CMN 对 EPCs 无明显毒性作用；代表 HO-1 表达量的光密度比值分别为（0.65±0.02）、（0.87±0.08）、（1.25±0.05）、（1.34±0.03），组间比较显著差异（P0.05），表明 EPCs 表达 HO-1 的量随 CMN 浓度的升高而升高。 3. 实验 3 中 A、B、C 三组测得的代表 HO-1 表达量的光密度比值分别为（0.47±0.04）、（1.43±0.02）、（1.11±0.05），B 组明显高于与 A 组与 C 组（均为 P0.05）。4. 实验 4 的 A、B、C、D 四组中，细胞增殖活力分别为（0.752±0.238）、（0.640±0.119）、（0.724±0.450）、（0.681±0.309）；VEGF 分别为（40.52±2.63)、(15.81±3.24)、(31.43±2.90)、(20.74±2.16)；bFGF 分别为（80.32±3.58)、(49.64±4.73)、(65.29±5.12)、(54.17±4.98)，上述 3 项指标的组间比较显示，B，C、D 组均明显低于 A 组（均为 P0.05），