家蝇铁蛋白基因的克隆 表达及功能分析-cloning, expression and functional analysis of ferritin gene from musca domestica.docxVIP

JIII河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名:再亏空l日期: 出lt年_j_月1 I日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文。本学位论文属于l、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。2 、不保密民/ (请在以上相应方格内打 ，J)F保护知识产权声明|惨葱印执龟句盼牙lì本人为申请河北大学学位所提交的题目为(，-..， 缸4 旦二泣注占知功能力手的学位论文，是我个人在导哺附加导并与导师合作下取得的研究成果，研 究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资 助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的 各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下:本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人: 合法为\ \/ 日期:生_!_L _6_J1 II 日作者签名: 导师签名:者 5? p-1trn主气日期:半主一年一月止日日期:4I (t 年J_J111日摘要在人体中，血清铁蛋白常被用于某些疾病的检测指标之一，它的稳态对人体来说非 常重要。同样，在家蝇(Musca domestica)中，铁蛋白的变化往往也可以反映出其对外界 环境应激做出的反应，这为家蝇的抗逆性及免疫方向的研究提供新的认识。家蝇因其特 殊的生活环境和较短的生活周期逐渐成为研究昆虫免疫的重要模式生物。本研究以家蝇 为实验材料，主要研究内容如下：第 1 部分：通过家蝇转录组数据的搜索结合 RT-PCR 及 RACE 技术得到 3 条铁蛋白Mdfer 基因的 cDNA 序列，并对其核酸序列及编码的氨基酸序列进行生物信息学的分析。 第 2 部分：通过 qRT-PCR 和 Western Blot 的方法对家蝇 MdferL 亚基和 MdferH 亚基的组织分布以及细菌和 Fe2+刺激下的表达模式进行分析。 研究结果如下：1、通过 RACE 技术获得了 3 条家蝇铁蛋白的基因序列，将其命名为 MdferL， MdferH1 和 MdferH2。MdferL 基因 cDNA 全长 1105 bp，包含一个 675 bp 的完整的开放 阅读框(ORF)，编码 224 个氨基酸，预测 MdferL 蛋白的分子量大小为 24.9 kDa。MdferH 和 MdferH2 是同一基因的 2 种可变剪接体，2 条序列分别长 1417 bp 和 1172 bp，它们具 有完全相同的 621 bp 的完整 ORF 序列和 3’非翻译区，编码同样的 206 个氨基酸，预测 蛋白的分子量大小为 23.1 kDa。2、qRT-PCR 结果显示，3 种铁蛋白 Mdfer 基因在家蝇肠道中相对表达量最高。细 菌刺激后 3 种基因的相对表达量都发生上调。Fe2+刺激后，3 种基因的相对表达量都发 生了显著地上调，并在较高的水平上维持稳定。3、Western Blot 实验结果显示，2 种蛋白都是在肠道中相对表达量最高。细菌刺激 后，MdferL 蛋白的表达量在 3-12 h 上调最明显，而 MdferH 蛋白的表达量则没有明显的 变化。Fe2+处理后，2 种 Mdfer 蛋白的表达量都发生了明显的上调，MdferL 蛋白在 Fe2+ 处理后的 24 h 到 36 h 其表达量最高，而 MdferH 在 Fe2+处理后的 3-6 h 表达量上调最明 显。这 2 种铁蛋白 MdferL 和 MdferH 在家蝇各个发育阶段里都存在，并且均在 3 龄幼 虫和成蝇阶段的相对表达量显著地高于 1 龄幼虫和蛹阶段。用不同浓度的 Fe2+刺激后发 现，MdferL 蛋白的相对表达量在 0.15-0.2 M 浓度范围内随着 FeSO4·7H2O 浓度的增大而I增大，而 MdferH 蛋白的相对表达量在 FeSO4·7H2O 浓度为 0.05 M 时达到最大。关键词家蝇铁蛋白可变剪接表达调控功能分析IIAbstractThe homeostasis of serum ferritin which is very im