猴金属硫蛋白α结构域的改造及其结构与功能关系的研讨.pdf

中文摘要 蛋白。金属硫蛋白参与体内的许多生理过程，如金属离子(如Zn”，Cu2+)的 体内平衡，对重金属离子(如cd2+，H92+)的解毒，扑灭体内的活性自由基等， 金属硫蛋白还参与生物体的许多重要的生理过程，如细胞凋亡、神经生长控制 (MT3)、衰老等过程。 金属硫蛋白(MTs)一般有两个结构域，对哺乳动物而言，氨基端为p结 构域，有3个二价金属离子和9个半胱氨酸配位形成；羧基端为旺结构域， 一般由4个二价金属离子和11个半胱氨酸配位形成。在两个结构域中，金属与 硫原子分别形成一个三核金属硫簇和一个四核金属硫簇。这两个金属硫簇是形 成MTs的三级结构的核心，因此配体与金属离子对MTs的高级结构有很大的 影响，从而也会影响MTs的生理功能。本论文中通过定点突变技术，将猴金属 硫蛋白MT1的仅结构域中第33和34位的半胱氨酸(Cys)分别突变为甲硫 的Cys是以端配的形式与金属离子结合，而第34位的Cys是以桥配的形式与 构域独有的一种序列，这样对33和34位的突变能够研究端配和桥配以及序列一 CCXCC--对Ⅸ结构域的形成有何影响。用不同的金属离子与MTs进行重组 反应，来研究野生型及其突变体蛋白中a结构域的性质与结构上的差异，从 而探讨这几种因素对0【结构域形成及功能的影响。 厂， ／7、弋为了得到分子均一，纯度高，以及足够量的野生型及其突变体金属硫蛋白， k。 需要建立一个能高效表达与纯化金属硫蛋白的体系。通过我们的实验和别人的 工作证实，在大肠杆菌蛋白表达体系中，不能直接有效地表达哺乳动物金属硫 蛋白。我们选用谷胱甘肽硫转移酶(GST)为融合蛋白的表达与纯化体系，通 过优化表达条件，改进纯化步骤与操作，最终成功地建立了一个高纯度和较高 产率的哺乳动物金属硫蛋白的表达与纯化体系，并获得猴MT—l的野生型及其 产率为每升发酵液可得约8-11 mg纯蛋白，是表达哺乳动物MT的同类方法中 产率最高的，比已发表的表达哺乳动物MT产率最高的Intein融合蛋白表达方 法的产率略高。 在FPLC蛋白纯化仪上，用阴离子交换树腊分离MT-1的野生型及其三个 突变体蛋自时，野生型及其突变体蛋白C33M只有一个主要的洗脱峰，而突变 体蛋白C34S和C33M／34S有两个主要的洗脱峰(fl和f2)，两峰峰面积之比分 别为2：1和1．1：1。分别收集每个峰对应的蛋白，用电喷雾质谱(ESI—MS) MTC34Sfl为6269．54±O．41： 6285．27； 6269．2l；MTC33M，34S 6313．24；MTC34S 6297．28)相吻合，这说明 MTC33M 突变体蛋白C34S和C33M／34S形成两种带电性不同的结构。测定它们的巯基 含量也符合理论值。利用原子吸收分光光度法和ESI．MS测定了这些蛋白的金 属含量，野生型蛋白、突变体蛋白C33M以及C34Sn和f2中均含有7个镉离 子，突变体蛋白C33W34S的两个流份n和f2所含的镉离子分别为6个和7个。 7．0 迸一步分析发现，突变体蛋白C34S和C33M，34S的两个流份f1和f2在pH 左右能够互相转化，并且在突变体蛋白C34S中．f1的相对稳定性高于f2，而 C33M／34S中f2的相对稳定性高于f1。突变体蛋白C34S的两个流份相互转化 的速度比C33M／34S的两个流份转化的速度快：这可能是C34S中n和f2均含 有7个镉离子，构型类似，易于转化，而C33M／34S中f1含有6个镉离子，f2 含有7个镉离子，构型差别比较大，转化时能垒较高，所以转化速度比较慢。 重组的猴金属硫蛋白的野生型蛋白和突变体蛋白的紫外(UV)吸收光谱类 似，均在250nm有一特征肩峰吸收，这是镉与硫之间电荷转移的特征吸收， 它们只是在摩尔消光系数的大小上有～些差别，其中突变体蛋白C34Sn的摩 尔消光系数最大。在圆二色(CD)光谱中，C33M与野生型蛋白光谱类似，均 在260砌(+)、240