巨尾桉cuznsod铜分子伴侣的克隆与表达研究-cloning and expression of cu2znod copper molecular chaperone from eucalyptus grandis.docxVIP

摘要铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）能清除植物体内有害的活性氧（ROS），参与植株遭受逆境胁迫时的应激反应等过程。铜分子伴侣（CCS）是铜分子伴侣家族之一，它可以传递铜离子到Cu/ZnSOD当中并将其激活生成有活性的酶分子，依赖CCS协助是Cu/ZnSOD主要的激活途径。本文以巨尾桉作为研究对象，通过RT-PCR的方法克隆得到巨尾桉CCS基因7个(NCBI基因注册号为：KJ755351.1)，龙眼CCS基因2个(NCBI基因注册号为：KR261666.1)。生物信息学分析表明CCS蛋白是定位于叶绿体、亲水、稳定的酸性蛋白质，该蛋白含2个跨膜螺旋，N末端朝外，由内到外进行跨膜。该蛋白主要由59.6%的无规则卷曲、29.5%的β-折叠和11.0%的α-螺旋等构成，并存在多个磷酸化位点和保守结构域，这些保守结构域的存在可能是激活SOD表达所必须的。采用clustalX对来自12种不同物种的CCS核酸序列作进化树分析，巨尾桉CCS与龙眼、葡萄、蓖麻同源并处于同一分支中，与它们间在进化距离上较为接近，一致性分别为99%、81%和80%。在巨尾桉CCS表达研究中，原核表达载体pET-EuCCS在大肠杆菌细胞内稳定表达，IPTG诱导CCS原核表达的优化条件是：IPTG终浓度1mM，温度37℃时，最佳诱导时间4h；而16℃和22℃诱导时，最佳诱导时间增加到12h和6h。利用氮蓝四唑法（NBT）对含有外源载体pET-EuCCS和空载的E.coli的SOD酶活检测结果表明，转化菌株pET-EuCCS的SOD酶活性比对照菌株高，说明CCS激活了Cu/ZnSOD的表达，并且生成了有活性的蛋白质，从而说明外源基因EuCCS是具有生物学活性的。利用荧光定量PCR技术研究CCS在巨尾桉中的表达特性发现，在植株生长旺盛的部位CCS表达量较大，如植株幼叶，随植株叶片慢慢衰老，CCS的表达量也随之下降；巨尾桉组培苗中，叶片的CCS表达量最大，其次是茎。对含有外源基因pBI-EuSOD的阳性转基因巨尾桉植株SOD酶活检测，发现比阴性对照组增加了38.5%-62.2%，说明Cu/ZnSOD在植物体内成功表达。为深入研究巨尾桉中Cu/ZnSOD和CCS在植物中的调控机理，构建了植物双基因表达载体两组，一是同时过量表达CCS和Cu/ZnSOD的植物二元双基因表达载体pBD-EuSOD-ZCCS，二是CCS沉默和Cu/ZnSOD过量表达的植物二元双基因表达载体pBD-EuSOD-FCCS，并利用农杆菌介导的叶盘转化法转化巨尾桉。关键词：巨尾桉铜锌超氧化物歧化酶CCS原核表达AbstractSuperoxidedismutases(Cu/ZnSOD)areimportantantioxidantenzymesthatcatalyzethedisproportionationofsuperoxideaniontooxygenandhydrogenperoxidetoguardcellsagainstsuperoxidetoxicity.Themajorpathwayforactivationofcopper/zincCu/ZnSODrequiringtheCCScopperchaperonetoinsertcopperandactivateCu/ZnSODthroughoxidationofanintramoleculardisulfide.ToinvestigateCCSgene，7EucalyptusCCSgenesand2LonganCCSgenesareclonedrespectivelybyRT-PCR(registednumberofNCBIGENE:KJ755351.1KR261666.1)BoinformaticssugeststhatCCSisakindofhydrophilicandstableacidicproteinlocatedinthechloroplast,whichcontains2transmembranehelicesandtransmitsthroughthemembraneforminsidetooutsidewithN-terminalahead.Inadditiontoseveralspecificphosphorylationsitesandcnserveddomains,whichmaybeessentialinactivatingSOD,theprotainconsistsof59.6%randomcoil,29.5%β-sheetand11.0%-helix.FurthermoreinthecomparisionofCCSnucleicacidsequenceof12differentspeciesbyclustal