人教版高中生物选修1专题5课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段课件共14张.ppt

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 【课题背景】 在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。 【课题目标】 1.理解PCR的原理和反应过程 2.尝试PCR技术的基本操作 3.讨论PCR技术的应用 PCR仪 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 1.胞内DNA复制的基本体系 一、基础知识 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 (一）PCR原理 2.DNA双链方向与复制关系 （2）DNA聚合酶只能从3 ´端延伸DNA链，故DNA复制需要引物。 （1）DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。 DNA合成总是从子链的5 ´端向3 ´端伸 3 ´端 5 ´端 3.PCR原理 （1）DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 ①变性： 80－100°C的温度范围内， DNA双螺旋结构解体，双链分开 加热变性 ②复性： 温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链 缓慢冷却复性 （2）耐高温的Taq DNA聚合酶 （3）缓冲液为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 【方法点拨】细胞内复制和PCR不同点 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 ② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 （二）PCR的反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步 (1)变性 温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链。 (2)复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (3)延伸 【方法点拨】 (1)72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。 (2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（ ） ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A．③④ B．①② C．①③ D．②④ C 【方法点拨】 1.PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶 2.PCR过程中，DNA不依靠解旋酶解旋，而是利用高温解旋，然后以单链DNA为模板进行复制 【典型例题】 二、实验操作 1.PCR仪 （一）设备及用具 一台能够自动调控温度的仪器 2.微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3.微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 1.准备 2.移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。 3.混合 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 ②注意: A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。 4.离心 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 ②目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C，10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 5.反应 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 【注意事项】 避免外源DNA等因素的污染 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。 在PCR实验操作中，下列说法不正确的是(　　) A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头 B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢 C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合 D．离心的