t10,c12cla对奶牛乳腺细胞srebp的调控及抑制乳脂合成的机理研究-study on the regulation of t10, c 12 cla on sr ebp in dairy cow mammary gland cells and the mechanism of inhibiting milk fat synthesis.docxVIP

独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，受国家自然科学基金青年基金、农业部公益性行业(农业〉科研专项经费(201303143)、浙江省公益技术研究农业项目(2013C32069)资助，在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名:是在他日期:}o1f;，á、写论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅:学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在一一年后解密可适用本授权书。口不保密，本学位论文属于不保密。口(请在方框内打.J)学位论文作者亲笔签名:东东得日期:刘轧盯指导教师亲笔签名:主进日期:Uìly、6，5摘要t10,c12CLA可通过降低乳腺上皮细胞内核转录因子nSREBP1的水平，引起牛奶乳脂率降低50%，降低牛乳营养成分，影响乳品质。本实验以牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)为模型，分别从转录、翻译后加工修饰以及降解调控水平研究t10,c12CLA降低nSREBP1水平的调控机制。为缓解低乳脂症(MFD)，提高乳品质提供参考。试验一t10,c12CLA对乳脂合成网络的影响以MAC-T为模型，检测乳脂合成网络基因的表达，观察脂滴分泌情况。不同梯度t10,c12CLA(0，75，150和300nM)处理MAC-T，westernblot筛选t10,c12CLA对nSREBP1的最佳抑制浓度，用它处理MAC-T，RT-qPCR和westernblot检测乳脂合成网络的mRNA丰度和蛋白丰度。结果显示，1)MAC-T能表达乳脂合成网络中的21个基因，能分泌脂滴；2)150nM的t10,c12CLA对nSREBP1的抑制效果最佳，并可显著降低ACACA，FASN，SCD1的mRNA丰度和SCD1的蛋白丰度。结果表明，MAC-T能作为本研究的模型，t10,c12CLA通过降低nSREBP1的水平下调ACACA，FASN，SCD1的mRNA表达，抑制乳腺组织内乳脂从头合成。试验二t10,c12CLA在转录和翻译后加工水平对nSREBP1的调控机制研究为了揭示t10,c12CLA对nSREBP1的调控机制，本研究观察150nMt10,c12CLA从不同水平调控乳腺上皮细胞内从nSREBP1基因的表达情况；结果显示，SCAP和INSIG1的蛋白丰度显著降低，因此，t10,c12CLA可能通过下调SCAP和INSIG1的蛋白表达妨碍pSREBP1从内质网转运至Golgi进行加工，引起nSREBP1减少。试验三t10,c12CLA在nSREBP1降解过程中的作用机制抑制26S蛋白酶体活性的基础上添加150nMt10,c12CLA，结果显示，SREBP1的mRNA丰度、pSREBP1和nSREBP1的蛋白丰度下降极显著，而SCAP的mRNA丰度反而上调，导致SCAP的蛋白丰度与对照组相比无显著变化。表明，在26S蛋白酶体被抑制后，t10,c12CLA通过某机制极显著下调了SREBP1的mRNA表达，即使SCAP的蛋白无显著变化，pSREBP1和nSREBP1的水平依旧下降显著。综上所述，t10,c12CLA通过下调SCAP和INSIG1蛋白表达，影响pSREBP1从内质网转运至Golgi的过程，使得进入Golgi加工的pSREBP1减少，最终导致MFD现象的发生。关键词：乳腺上皮细胞，SREBP1，t10,c12CLA，SCAP，26S蛋白酶体。IABSTRACTThet10,c12CLAmayreducethemilkfatto50%percentagethroughdecreasingtheSREBP1.Thisstudywasconductedtoexploretheregulationmechanismoft10,c12CLAonthegeneandtranslationexpressionofSREBP1inMAC-Tcells,usingthemammaryepithelialcelllinesasmodel,andsupplysomeimplicationtoreleasetheMFDcausingbyhighconcentratedratioandimprovethemilkquality.Trial1:Effectsoft10,c12CLAonfattyacidsynthe