油茶总皂甙抑菌.ppt

油茶总皂甙的抑菌活性及清除活性氧能力初步研究 吴郭燚 研究目的 本研究以粗提的油茶总皂甙为药剂，采用体外抑菌活性实验方法探讨了油茶总皂甙对常见的食品腐败菌的抑菌活性，并初步研究了油茶总皂甙对O2-·和·OH的清除作用，为能有效开发油茶饼中的功能性成分，提高油茶饼的有效利用率和减少资源浪费等方面起到促进作用。 研究意义 生物体内自由基导致的脂质过氧化与抗氧化的平衡与一些疾病和炎症的发生有密切关系。活性氧（ROS）是由于连续的单电子还原而产生一系列毒性中间物，其中危害较大的包括超氧阴离子自由基(O2-)和羟自由基（·OH）。其中，O2-·可以通过细胞膜的阴离子通道，与一些生物分子直接反应；·OH的氧化能力最强，一旦产生，就与碰到的任何分子发生反应。因此，清除活性氧对防御疾病有重大意义。 试验方法 1实验材料 1.1 实验原料 油茶饼：购于湖北省麻城市，成分含量测定：凯氏定氮法[3]测得粗蛋白为16.27%；索氏抽提法[4]测得脂类为7.35%；碳水化合物[5]为45.65%。 1.2 实验菌种 食品腐败菌：大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，武汉大学生命科学院微生物实验室提供。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。 试验方法 2实验方法 2.1 油茶皂甙的提取 将油茶饼粉碎，取100g以l：3的料液比将样品及75%乙醇[6]装入索氏提取器，置于70℃水浴锅中水浴2小时，抽滤得滤液；将滤渣仍以1：3的料液比进行二次浸提[7]；合并滤液加入适量活性炭，静置过夜，处理二次；抽滤得滤液，低温浓缩，浓缩液中加入等体积的石油醚萃取以脱去脂肪，真空冷冻干燥，得到油茶总皂甙样品。 （料液比是质量与体积比，即100g：300ml。） 试验方法 2.2 油茶皂甙标准品制备 纯化：将预处理过的AB-8树脂装入10×300mm的层析柱中，装柱高度240mm。油茶皂甙样品溶于65%乙醇，80℃水浴冷凝回流2h，4000r/min离心10min，得乙醇提取物。在层析柱中加入10mL处理后的乙醇提取物，上样流速1mL／min，上样结束后，加入50mL的去离子水洗脱，流速为设置为1mL／min，再用50％的乙醇洗脱，流速0.5mL／min，收集洗脱液，控制每管量为5mL，进行浓缩。将油茶皂甙浓缩液加入等体积丙酮，搅拌混匀，4℃暗抽提24h，4000r／min离心5min，得油茶皂甙沉淀，去掉上清液，真空冷冻干燥，得淡黄色油茶皂甙晶体，即为高纯度的油茶皂甙标准品。 纯度验证：称取少量所得标准品，溶于甲醇溶液中，浓度约为1mg/mL，进行紫外光谱扫描，得紫外光谱图。 试验方法 2.3 供试菌种准备 菌种活化：取菌种使用划线法将其接种于固体培养基中，培养24h；挑取单菌落于相应液体培养基中，37℃培养24h。 2.4 不同浓度茶皂素溶液的配置 将50%的油茶皂甙样品溶液灭菌后分别用无菌水稀释成50%、20%、15%、10%、5%、2.5%、1.25%等浓度梯度，备用。 试验方法 2.5 抑菌试验 2.5.1细菌生长活性实验 分别配制一定油茶皂甙样品浓度的培养基斜面，倒置37℃培养48h，经无菌检验合格后，用无菌生理盐水分别将活化后的微生物菌种制成分散均匀的悬浮液，调整浓度，使菌体或孢子浓度约为106个／mL，吸取0.1mL菌悬液涂布平板，37℃恒温箱中培养，待未加药物的对照管中细菌形成良好菌落后即读取结果[8]。 2.5.2抑菌圈测定 将活化后的菌种准确吸取1mL原菌液，分别稀释成10-1、10-2、10-3三个浓度梯度。吸取0.1ml稀释后的各菌液，涂布平板，再用镊子将浸过不同浓度油茶皂甙液且凉干后的圆滤纸片(滤纸起始直径为10mm)放于培养基平板中，37℃下倒置培养24h [9]。按垂直方向量取各抑菌圈直径，记录结果，每种滤纸片做3次重复，结果取平均值。 试验方法 2.6 油茶总皂甙清除O2-·的能力测定 根据文献[10、11]采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在弱碱性(磷酸盐缓冲液pH8.2)环境中自身氧化分解产生O2-·，该体系常用于测定SOD或类似SOD活性物质对O2-·的歧化活性。随着反应的进行，O2-·在反应体系中不断积累，导致反应液在325nm处的吸光值其后5min内随时间变化而线性增大。因此在该时间范围内于325nm处测定含油茶总皂甙反应液的吸光度随时间的变化率，并与维生素C比较，便可得出被测物清除O2-·的能力。 试验方法 2.7 油茶总皂甙清除·OH的能力 清除·OH能力的测定采用文献[12]方法。 实验结果与分析 3.1 油茶皂甙标准品纯度检测及粗制样品含量测定 紫外光谱分析如图1所示，采用重结晶法制备