过氧化氢对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白表达影响.docVIP

过氧化氢对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白表达影响 　　【摘要】目的采用体外研究方法,探讨过氧化氢(H2O2)对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白(Grx)表达的影响。方法体外分离培养原代人结肠上皮细胞;通过相同浓度H2O2或不同H2O2浓度刺激原代人结肠上皮细胞,使细胞处于氧化应激状态,应用MTT比色法检测不同浓度的H2O2对细胞活力的影响,半定量RTPCR检测H2O2对细胞Grx基因表达的影响。结果400μmol/L以上的H2O2降低细胞活力;300μmol/浓度的H2O2在一定时间内,随刺激时间的延长,Grx基因表达相应增加(P 　　【关键词】过氧化氢;谷氧还蛋白;氧化应激;原代人结肠上皮细胞 　　 　　结肠癌是威胁人类健康的最常见肿瘤之一,目前为止其发生和发展机制尚未完全阐明。已有研究表明,过氧化氢(H2O2)等活性氧引起的氧化应激在结肠癌的发生发展中起着重要作用,而谷氧还蛋白(Grx)参与了细胞内氧化还原状态的维持,且可能在细胞内氧化还原状态的调控以及抵抗氧化应激过程发挥重要作用。但H2O2引起的氧化应激是否对人结肠上皮细胞Grx产生影响至今未见报道。所以本实验以原代培养的人结肠上皮细胞为研究对象,观察氧化应激是否可引起细胞Grx的高表达,试图为探讨结肠癌的发病机制和治疗提供一定的理论依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1原代人结肠上皮细胞的培养参照文献的方法培养人原代结肠上皮细胞。具体方法如下:取本院病理证实的结肠癌患者,术前征得患者同意,手术中取距肿瘤至少10cm的正常结肠组织,立即用DHanks液冲洗干净,剪成1cm2的小块,剪碎,转入含50mlDHanks离心管中室温下800g离心15min,把沉淀转入100ml的烧杯中。 　　加入25mg/L的嗜热菌蛋白酶消化液50ml(购自美国Sigma公司),37℃震荡40min,800g离心5min;将沉淀转入20mlⅠ型胶原酶(北京鼎国公司),37℃震荡40min,1000g离心10min;用DHanks液将沉淀反复吹打10min,400μm分样筛滤过后收集过滤液,再用80μm的分样筛滤过,反转分样筛后,用DHanks反复冲洗,收集冲洗液,1000g离心5min,将细胞沉淀悬浮于含10%胎牛血清(杭州四季清)的DMEM完全培养基中,种植在25cm2的培养瓶中,37℃,5%二氧化碳孵箱内培养90min后,把培养液连同未贴壁的细胞转入新培养瓶中,每48h更换培养液1次,约15d汇合成片。按常规培养细胞方法传代,在第一次传代的前3d加入0.05g/LⅠ型胶原酶,继续培养,当细胞传至5~7代时作为实验的研究对象用。 　　1.2四唑盐(methyltetrazolium,MTT)比色法检测细胞活力将原代人结肠上皮细胞分成6组,各组设5个重复样品,分别为:正常对照组(未加任何处理因素)、100μmol/LH2O2、200μmol/LH2O2、300μmol/LH2O2、400μmol/LH2O2、500μmol/LH2O2组,以每孔103个细胞的密度接种于96孔培养板中,待细胞完全汇合后,换成无血清DEMN培养基。按上述分组处理细胞,继续培养60min后,每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl,37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育4h,弃培养液,加入150μlDMSO振荡仪振荡10min,至晶体颗粒溶解,在酶标仪上测定490nm的吸光度值(A值)。 　　1.3半定量RTPCR扩增Grx和βactin基因时间相关性研究中,将原代人结肠上皮细胞如下分组:第1、2、3、4、5正常对照处理时间分别为0、10、20、30、60min组,第6、7、8、9、10分别为300μmol/LH2O2作用0、10、20、30、60min组。剂量相关性研究分组:第1组为正常对照组(0μmol/LH2O2),第2、3、4、5、6组分别为100μmol/LH2O2、200μmol/LH2O2、300μmol/LH2O2、400μmol/LH2O2、500μmol/LH2O2,刺激时间30min。细胞传至6孔板,完全汇合后,换成无血清培养基,按上述分组处理,继续培养后,收集细胞,参照Trizol试剂盒(日本Takara产品)说明书提取细胞总RNA,以紫外分光光度计检测其浓度和纯度,A260/A280比值在1.7~19之间,提取后予低温冰箱保存以备扩增Grx和βactin基因用。 　　Grx引物序列为:上游引物5GCATGGCTCAAGAGTTTGTG3,下游引物为:5CCACCAGAAGTGCTGTCATCATT3,扩增片段长度400bp,内参βactin上下游引物分别是5GTGGACATCCGCAAAGAC3以及5GAAAGGGTGTAACGCAACT3,βactin扩增的产物30