长期力竭性训练对大鼠海马神经元凋亡影响.docVIP

长期力竭性训练对大鼠海马神经元凋亡影响 　　摘要：目的：研究长期力竭性训练对大鼠海马神经元凋亡的影响及其基因调控机制；方法：对大鼠进行为期8周的力竭性游泳训练，用DNA原位末端标记法检测海马神经元的凋亡，并用免疫组化的方法观察海马神经元中bcl－2、bax的免疫反应活性；结果:1) 长期力竭性训练后，大鼠海马神经元凋亡显著增加。海马神经元凋亡可能是力竭性训练导致运动能力降低和中枢性运动疲劳的病理生理机制。2) 长期力竭性训练后，大鼠海马神经元中bcl－2蛋白的表达显著下降，bax蛋白的表达显著增加。因此，力竭性训练可抑制海马神经元bcl－2蛋白的表达而促进bax蛋白的表达，这可能是力竭性训练导致大鼠海马神经元凋亡发生的基因调控机制。 　　关键词：细胞凋亡；力竭性训练；海马神经元；bcl－2；bax 　　中图分类号：G804.23文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)08-1060-03 　　 　　运??作为一种刺激，机体可产生“双向”的适应性变化，适当的运动可增强体质，增进健康；不适当的运动可危害身体的健康。一般认为，外界刺激引起细胞代谢的紊乱有3种情况:对强度较小的刺激，细胞能通过改变自身的代谢途径来抵御；当刺激达到较大强度时，可引起细胞凋亡；当刺激强度过大超过机体生理承受能力时，可引起细胞坏死［1］。本研究从分子生物学角度探讨海马神经元凋亡在运动训练病理改变中的作用及其分子调控机制。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1实验动物及喂养成年四月龄，雄性、SPF级（无特定病原体动物）的SD( Sprague-Dawley)大鼠26只，体重(206.76±15.69)g，由华西医科大学实验动物中心提供。随机分为对照组(n=6)、1 h训练组(n=8)和力竭训练组(n=12)。分笼饲养，每笼4～5只，标准啮齿目动物饲养笼喂养，自由摄食饮水，鼠粮由华西医科大学实验动物中心提供。每天上午、下午各清扫动物房一次，并且上午、晚上换水和添加饲料各两次；保证通风条件良好，室温保持在(25±2)℃，相对湿度40%～60%，自然光照。 　　1.2实验方法 　　1.2.1运动条件游泳池采用无色透明玻璃缸，体积150 cm × 40 cm × 80 cm，水深60 cm，超过大鼠身长的2倍，水温(35±1)℃，水深60 cm。每次实验前??重新换水，并静置12 h。 　　1.2.2运动方式无负重游泳。 　　1.2.3训练方案 　　1.2.3.1对照组平时不运动，饲养条件与运动训练组相同。 　　1.2.3.21 h训练组前3 d适应性游泳30 min,并在1周内逐渐延长时间至60 min，然后每天游泳1次，每周6次，持续7周，训练时间共8周。 　　1.2.3.3力竭训练组前3 d，适应性游泳30 min，并在1周内延长时间至120 min,训练1周后，对大鼠进行力竭性游泳训练，力竭标准［2］:1）大鼠沉入水下无法返回水面超过10 s； 2)大鼠协调运动消失，在水中无方向性地乱窜，虽未达到10 s亦定为力竭。发现上述情况，及时捞起，用毛巾擦干，置笼中休息。每天1次，每周6次，持续4周。最后2周，每天早、晚1次，每周6 d，对在短时间内力竭的大鼠，捞出休息5 min后，再进行游泳训练，使训练时间不少于2 h。训练时间共8周。 　　1.3取材力竭训练组末次游泳后，称重，按2.3 mL/kg体重腹腔注射刚配制的2%的戊巴比妥钠。麻醉程度要求：仰卧, 刺其尾巴时，不能转向一侧，并有很微弱反应。将其仰卧，缚住四肢及头部，然后打开大鼠的胸腔，暴露心脏，快速地通过左心室向主动脉插进针头，用止血钳固定心尖部及针头；然后打开生理盐水的开关，用止血钳夹住下行动脉，剪开右心房让血液??出，直到发现流出液变清，则关闭生理盐水开关，打开4%多聚甲醛灌注液的开关，解开头部及四肢，可见到上肢及头部肌肉痉挛渐硬、变白。待见到灌注液从鼻中滴流出，则关闭多聚甲醛开关。用断头铡将头取下，用剪刀自枕骨大孔两侧沿耳朵稍后上方各剪一刀(注意不要破坏脑部)，翻起颅骨，将大脑轻轻取下，置于托盘中在视交叉后1 mm及4 mm处冠状切面切开，取中间块放入装有4%甲醛液的小瓶中浸泡固定，室温贮存(备HE染色、细胞凋亡检测及免疫组化用)。对照组和1 h训练组同样处理。 　　1.4切片制作 标本固定24～48 h后，常规石蜡包埋，连续切片6～8张，厚度4 um，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，60℃烘烤过夜，备用。 　　1.5指标检测 　　1.5.1HE染色切片脱蜡人水，苏木精染色10 min，水洗，盐酸酒精分化，充分水洗后，伊红染色3～5 min，水洗，脱水、透明、封片。 　　1.5.2海马神经元凋亡及bcl-2, bax基因蛋白的检测海马神经元凋