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Zn对AM真菌侵染紫云英转化根影响 　　摘要：分别建立丛枝菌根（ＡＭ）真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ与紫云英转化根双重共培养体系，并利用该体系研究不同Ｚｎ浓度对单接种与混合接种ＡＭ真菌侵染紫云英转化根的影响。结果表明，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ提高了大部分处理的根段侵染率、菌丝密度以及Ｐ的吸收，０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ抑制了ＡＭ真菌菌丝的生长，但能增加部分处理转化根对Ｐ的吸收。０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ浓度下，单接种Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、混合接种Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率最高，并且在混合侵染根段中Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ根段侵染率比Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ高１２％。 　　关键词：丛枝菌根（ＡＭ）真菌；转化根；共培养；Ｚｎ；Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ 　　中图分类号：Ｑ９３９．５；Ｑ９３５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0685-05 　　丛枝菌根（ＡＭ）真菌是一类与植物专性共生的真菌，能与８０％以上陆生维管植物形成互惠共生体，促进植物吸收矿质营养，增强植物抵抗逆境胁迫及病害的能力［１］。ＡＭ真菌营专性共生生活，至今尚未实现离体纯培养。传统的盆栽培养方法费时费力，无法避免外来细菌与真菌的污染，无法避免土壤缓冲和固结等干扰因素，只能进行生理学与形态学观察。相对意义的离体纯培养经历了植物正常根系与ＡＭ真菌、植物转化根系与ＡＭ真菌双重共培养两个阶段。植物转化根与ＡＭ真菌双重共培养体系的优点是能够提供纯净、没有污染的任何生长阶段的ＡＭ真菌研究材料［２，３］，并且转化根生长旺盛，缩短了ＡＭ真菌与宿主建立共培养体系的时间，比起传统盆栽材料，更适合做形态学、超微结构、生理学、生物化学和分子生物学上的研究，为菌种鉴定和描述提供了可靠材料［４，５］。 　　Ｚｎ是植物体必需的微量元素，但是高浓度的Ｚｎ却有毒害作用，可能引起氧化性损??［６，７］。而ＡＭ真菌的某些蛋白质参与抗氧化反应的调节，能有效缓解Ｚｎ的氧化压力和毒性［８］。此外，ＡＭ真菌通过增加自身生物量、根内和根外菌丝量来增加对Ｚｎ的固定或者分泌金属螯合物如蛋白质球囊霉素来缓解Ｚｎ对植物的毒害［９］。 　　本研究拟在平板上建立ＡＭ真菌与转化根共培养体系，研究不同Ｚｎ浓度对３种ＡＭ真菌单接种或双接种侵染紫云英转化根以及吸收Ｐ、吸收Ｚｎ的影响，为在分子水平上研究ＡＭ真菌的抗Ｚｎ机制提供有利的技术平台。 　　１材料和方法 　　１．１材料 　　ＡＭ真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ，Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ来自法国，为盆栽培养所得接种剂；Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ为与胡萝卜转化根培养所得，由法国农业科学院（ＩＮＲＡ）Ｖｉｖｉｅｎｎｅ Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ－Ｐｅａｒｓｏｎ教授惠赠；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕａ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）、发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）Ｋ５９９由华中农业大学微生物学国家重点实验室生物固氮室提供。 　　１．２方法 　　１．２．１特异性引物的设计分别抽提３种AM真菌孢子的ＤＮＡ，用真核生物通用引物ＬＲ１和ＮＤＬ２２扩增核糖体25S ｒＤＮＡ序列，ＬＲ１的序列是：５′－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡ－３′，ＮＤＬ２２的序列是：５′－ＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧ－３′［１０］，得到的片段大小为７５０ ｂｐ，将ＤＮＡ条带回收纯化，转化到大肠杆菌ＤＨ５α中，取阳性菌菌液测序，得到序列后进行比对，设计特异性引物并进行验证。 　　１．２．２接种ＡＭ真菌和紫云英转化根共培养参考并改进Ｃｈｏ等［１１］的方法诱导转化根：选取颗粒饱满大小均匀的紫云英种子，用体积分数为７５％的乙醇溶液处理８ ｍｉｎ，无菌水冲洗５次，用体积分数为３％的次氯酸钠溶液表面消毒１０ ｍｉｎ，无菌水漂洗５次以尽可能除去种皮表面残留的次氯酸钠。将种子浸在无菌水中，置于２８ ℃培养箱中充分吸涨，平铺于含５ ｇ／Ｌ蔗糖的琼脂平板上，置于光照培养箱（１６ ｈ／ｄ，２２～２５ ℃）培养５～７ ｄ，取子叶展开的无菌幼苗，用解剖刀将下胚轴中部切断，弃根，将紫云英幼苗伤口处浸没于培养至对数期的发根农杆菌Ｋ５９９菌液中，浸泡１５ ｍｉｎ，取出放于无菌滤纸上，吸干子叶表面所带菌液，将幼苗置于含ＭＳ培养基［１２］的平板光照培养。３ ｄ后将带有发根农杆菌Ｋ５９９的幼苗转入含有卡那霉素（４０ μｇ／ｍＬ）和羧苄青霉素（５０ μｇ／ｍＬ）的ＭＳ培养基中除菌并诱导发根。３周后紫云英幼苗愈伤组织处长出转化根，剪下约５ ｃｍ根尖，转接到与ＡＭ真菌