日本血吸虫无机焦磷酸酶(SjPPase)的结构功能研讨.pdfVIP

  万方数据 摘要 背景：无机焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase, PPase ）是一类催化无机焦磷酸盐(PPi)水解生成磷 酸盐的蛋白质。PPi 是生物大分子（如 DNA ，RNA ，蛋白质和糖原等）生物合成过程的副产物，PPi 的水解反应将在热力学上促进生物大分子的合成。另外，PPi 也是硫酸盐还原反应的一个产物，PPi 的水解反应促进了硫酸盐的利用，为半胱氨酸、及甲硫氨酸等的合成提供硫源。 目的：建立日本血吸虫无机焦磷酸酶重组表达与纯化方法，研究其分子性质并解析其晶体结构，为 阐明其结构功能关系、研究其在血吸虫病防治上的应用奠定坚实的基础。 方法：分子克隆 SjPPase 基因至 pET-28a 质粒，将重组质粒导入大肠杆菌 BL21 （DE3 ），IPTG 诱导 表达 SjPPase 重组蛋白；超声裂解菌体，上清经 6×His-Tag 特异性结合 Ni-NTA 柱与弱阴离子 DEAE 柱两步分离、纯化获取高纯度蛋白。使用比色法测定反应产物磷酸盐（Pi ）在不同时间的浓度来计 算 SjPPase 的酶学活性，以及抑制剂的抑制活性。利用Cross-linking 反应对 SjPPase 溶液状态下的聚 集行为进行研究；采用 Native电泳探索 SjPPase 与一些小分子之间的相互作用。运用 ELISA 法测定 SjPPase 作为血吸虫病诊断抗原的敏感性和特异性。应用气液扩散法进行 SjPPase 蛋白酶的晶 体生长并收集其 X-Ray 衍射数据，解析并分析其晶体结构。 结果：制备得到了纯度较高（95% ）的 SjPPase 重组蛋白；测定了其不同温度和 pH 时的酶学活性， 其中最适温度和 pH 分别在 60℃和 7.0 附近；测定了抑制剂NaF ，MDP 以及IDP 的抑制活性，它们 的半抑制浓度IC50 依次为 1.92mM、3.72mM 和 4.97mM ；在溶液状态下，SjPPase 分子是以二聚体聚 集形成的多聚体形式存在；研究结果显示，Mg2+和 SjPPase 分子中的半胱氨酸对于维持 SjPPase 结构 的稳定性非常重要，在 SjPPase 分子中存在底物结合的非活性中心位点；解析并分析了 SjPPase 的空 间结构及其与功能的基本关系。 关键词：无机焦磷酸酶；活性；抑制剂；晶体结构 Ⅰ  万方数据 Abstract Background ：Inorganic pyrophosphatase (PPase) is an enzyme catalyzing the hydrolysis of pyrophosphate (PPi) given two phosphates (Pi). As a byproduct of biosynthesis of macromolecules, the hydrolysis of PPi provides a thermodynamic pull for synthesis reactions of DNA, RNA, protein and glycogen. In addition, PPi is also one of product from sulfate reduction. The hydrolysis of PPi is resulted in the increasing of the reducing sulfate for these synthesises of cysteine, homocysteine and methionine. Objectives ：To establish a set of methods for recombinant expression and purification of PPas