生物分离及纯化技术(生化工艺)第4章 固相析出分离技术.ppt

A 稳定区： 不饱和区 B 第一介稳区：不产新晶核，溶液可以稳定存在，但加入晶种结晶会生长 C 第二介稳区：加入晶种结晶会生长，同时有新晶核产生 D 不稳区：瞬时出现大量微小晶核，发生晶核泛滥，容易析出沉淀 晶核的诱导 很多生物分子自发成核机会很小，通常可加入晶种诱导结晶。 晶种的获得：（1）直接将已经析出的晶体研碎后作为晶种；（2）取少量结晶液缓慢蒸干后获得少量晶体 三、晶体的生长 分子在以晶核为中心的晶体表面有规则的排列使晶体体积增大的过程称为晶体的生长。 影响因素： 过饱和度：过饱和度适当高一点会使晶体增大，但过饱和度过高易析出沉淀 温度:分子扩散，温度低则晶体细小 搅拌速度：促进分子扩散，但加快成核速度，搅拌速度高造成晶体细小 杂质：有的杂质能抑制晶体生长 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉点的工作原理是什么？ 影响结晶的因素、结晶操作。 第4章 固相析出分离技术 固相析出：通过改变温度、pH或加入一定的化学试剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而以固体形式从溶液中析出的过程。 根据析出固体的特征，固相析出技术分为沉淀和结晶技术。 固相析出的目的： 通过固相析出达到浓缩的目的； 固相析出方法可有选择地析出杂质或有选择地析出所需成分，初步纯化或高度纯化； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 固相析出技术特点：操作简单、成本低、浓缩倍数高 沉淀法和结晶法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 概述 盐析 概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 特点：不易导致蛋白质变性、操作简单、不需特殊设备，盐析后需对蛋白质脱盐处理、容易引起蛋白质共沉、一般作为粗提纯方法　 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 1 盐析用盐的选择 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 盐析用盐的选择 缺点： （1）水解变酸； （2）高pH 释氨，腐蚀； （3）残留产品有影响。 一般说来，盐浓度越大，蛋白质的溶解度越低，但不同种类的蛋白受盐浓度影响不同，因此可通过改变盐浓度分别使不同的蛋白质沉淀 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。 在进行分离的时候，一般从低盐浓度到高浓度顺次进行。 2 盐浓度对盐析效果的影响 盐析用盐量的确定——饱和度： 饱和度（Saturation）的概念： 其中：S为饱和度，c为盐浓度，c0为盐的饱和浓度 目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。 对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mg／L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。 3 pH值对盐析的影响 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。 为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4 温度对盐析的影响 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。 但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 5 蛋白质浓度对盐析的影响 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。 盐析操作 硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入