疟原虫镜检技术-制片与染色PPT.pptVIP

疟原虫镜检技术血片的制作与染色 安徽省疾病预防控制中心 地方病与寄生虫病防治科 赵立胜 一、材料 玻片：推玻片（具有光滑的边缘）、载玻片 一次性采血针 75%的医用消毒酒精（湿棉球） 干棉球（止血用） 标签、记号笔：载玻片上标识与编号 玻片盒 玻片的处理 　　　新玻片常有游离的碱质，使用前应用重铬酸钾洗液或稀盐酸（将浓盐酸稀释10倍）浸泡24小时，然后用自来水反复冲洗，晾干或烘干备用。 　　　旧的玻片，应放入5%的肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟，再用热水将肥皂或血膜等污物洗去，用自来水反复冲洗，必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。 二、采血 采血部位：患者的耳垂或指尖。耳垂采血的优点是痛觉不明显，不易感染，但血液循环较差，采血前应适当按摩使其充血，婴幼儿可以选择拇趾或足跟处采血。 采血方法：先用酒精棉球消毒采血部位，待干后用左手的拇指和食指固定采血部位，右手持采血针迅速刺入组织1至2mm，取出采血针，血液自行流出，若血液不畅，可以在离刺孔较远的四周稍加压力，不得靠近用力挤压，以防组织液混入待检的血液中。采血后用干棉球压迫止血。 三、制片 疟原虫镜检要求在一张玻片上必须同时制作厚、薄血膜。 涂制厚血膜：取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的右端1/3处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。 厚、薄血膜的位置 每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图 染色前血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下水平插入标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。 血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。 不能及时染色的血膜，可先用玻棒蘸取甲醇或无水酒精在薄血膜上轻轻涂抹（注意勿使固定液沾到厚血膜上）。厚血膜必须先进行溶血，可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰色时，将水倾去，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1~2小时后取出血片。 血膜的染色 染色液的制备：推荐使用吉氏染液。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质。 吉氏染液配制：吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 染色用水：为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果最佳。中性的蒸馏水也可。 缓冲液配制 pH 1/15mol/L 磷酸氢二钠溶液 1/15mol/L 磷酸二氢钾溶液 蒸馏水 （ml） 6.8 4.9 5.1 90 7.0 6.3 3.7 90 7.2 7.3 2.7 90 7.4 8.1 1.9 90 染色方法 少量血片染色：取吉氏染液1份，加入缓冲液或蒸馏水15至20份，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分钟，然后用缓冲液或蒸馏水将血片上的染液冲走，晾干待检。 染色方法 成批血片染色：将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏染液浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥待检。 注意事项 染色效果的好坏与稀释用水的氢离子浓度（pH）、染液的浓度、染色时温度的高低、染色的时间长短、染液配制的时间长短等都有密切的关系，因此，每批血片染色前要进行试染，以取得更好的染色效果。