双抗体夹心.pptVIP

酶联免疫实验 ——双抗体夹心法 一理论知识回顾 （一）酶免疫技术 酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。它是将酶和抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时有保留了酶对底物的催化活性。在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位，定性或测定的分析测定。他通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。 （二）酶免疫技术的特点 1灵敏度高，特异性强，准确性好。 2酶标记试剂能够较长时间保持稳定，操作简单，对环境没有污染。 3易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。 （三）酶免疫技术的分类 酶免疫技术可以分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定。后者根据是否需要结合和游离的酶标记物分离而分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。异相酶免疫测定又根据测定方法是否使用固相支持物而分为液相和固相酶免疫测定两大类。 二双抗体夹心法测HBSAg （一）实验原理 先将特异性抗体连接在固相载体上，形成固相抗体；加入待测标本和酶标抗体并温育，使标本中的抗原与固相抗体以及酶标记抗体充分反应，形成双抗体夹心免疫复合物，洗涤除去其他未结和物；再加入酶的底物（即显色剂）并温浴。最后加入终止液，根据颜色深浅判断抗原含量。颜色深浅与抗原量成正比。 （二）实验试剂与器材 1HBSAg检测试剂盒 2加样枪 3温箱 4待测血清 （三）操作步骤 1 用蒸馏水将洗涤液作20倍的稀释成洗涤工作液，充分摇匀后备用。 2 取出包被板，做好标记。留一孔做空白对照，其余加入阳性对照二孔和阴性对照三孔50ul/孔（或1滴／孔）及待测标本50ul／孔与相应的反应孔内，随即加入酶结合物50ul／孔（1滴／孔），空白对照孔不加，振荡混匀后，贴上板贴，置37度温箱中孵育30min。 3 撕下板贴，洗板5次（先弃去孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔，防止串流，停5-10s弃去，如此反复5次，每次均拍干）。 4 加入底物50ul／孔（或1滴/孔），随即加入显色剂50ul／孔（或1滴/孔）， 混匀，置37度避光温育10min。 5加终止液50ul／孔（或1滴/孔），振荡混匀后，立即测试结果。 6以空白孔调零，在450nm波长处用酶标仪测各孔OD （四）结果判定 1 结果有效性 ： 阴性对照OD值应该小于0.1，阳性对照的OD值减去阴性对照孔OD值应大于0.6，否则应重新实验。 2 CUT OFF 值计算： CUT OFF值=2.1×阴性对照孔平均OD值（阴性对照孔OD值小于0.05时，应按0.05计算） 待测样品的OD值 ≧ CUT OFF值者，判为HBsAg性，否则为阴性。 （五）注意事项 1 试剂盒自冰箱中取出室温平衡30min以上。 2 手工洗板时应避免孔内液体外溢，以防止相邻孔相互污染造成假阳性。 3 实验终止后20min内结果有效。 谢谢！！ * * *