12基因工程基本操作程序.ppt

§1－2 基因工程的基本操作程序 gene engineering 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和鉴定 一、目的基因的获取 获取目的基因的方法 从基因文库中获取目的基因 基因组文库 部分基因文库（cDNA文库） 利用PCR技术扩增目的基因 人工合成法（DNA合成仪） 反转录法和化学合成法 基因文库 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库 若基因文库中包含一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库 ⒉利用PCR技术扩增目的基因 PCR聚合酶链式反应 1988年 穆里斯等人 在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术，由此可获得大量目的基因。 PCR技术原理 在了解DNA一级结构基础上设计引物，DNA多聚酶可识别并结合引物，以单链DNA为模板,dNTP为底物，合成其互补链，通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。 PCR的反应步骤 1．变性：通过加热到94℃使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 2．退火：当温度突然降低到55℃时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少， 3．延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5′--3′的聚合酶在70℃下催化以引物为起点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于二个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达200万至2000万拷贝 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环—退火 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 二、基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体 目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 启动子 终止子 目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 启动子 基因（目的）的首端，有特殊结构的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位 启动子决定了双链的模板链 终止子 基因（目的）的尾端，转录终止信号 标记基因 为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 由RNA聚合酶所催化的转录 RNA聚合酶识别启动子 三、将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 ⒈将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法 农杆菌的特点 农杆菌转化法 基因枪法（微弹轰击法） 利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 单子叶植物，成本高 花粉管通道法 在植物授粉后，花粉形成的花粉管还没愈合前，剪去柱头，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 转基因抗虫棉 简便经济 ⒉将目的基因导入动物细胞-显微注射法 ⒊将目的基因导入微生物细胞 原核生物（大肠杆菌） 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ⒊将目的基因导入微生物细胞 四、目的基因的检测与鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术 检测目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原－抗体杂交 ⒈检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术 2.检测目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术 3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交 4.个体生物学水平的鉴定 抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度 有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同 DNA探针 利用基因的特性破案 P15－1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； 有时需要确定目的基因表达的产