生化技术_课件 第一章 生命大分子物质的制备课件.pptVIP

5.蒸馏法: 减压加温蒸发浓缩:通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 利用有些生命大分子物质自身可以吸收特定光波的能量后，发出荧光的特性而建立的一种方法。 精确性 重复性 灵敏度 比吸收光谱法好 荧光光谱法 浊度法 主要用于悬浮液的测定。 测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。 不被吸收，主要是散射、反射。 光谱法 电化学法 生物活性检测法 免疫分析法 生物传感器 吸收光谱法 荧光法 浊度法 直接测定法 比色法 第三节 细胞的破碎 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。 如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 一、机械破碎 1.研磨法：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 2.组织捣碎器法：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。 注意温度的影响 二、物理法： 1.超声波法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长久一些。 2.压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1.77×108Pa～3.54×108Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 3.冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 三、化学与生物化学方法： 1.自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2.溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 3.有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 4.酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 第四节 抽 提 一、抽提 抽提：指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。 是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性。 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。 二、抽提有效成分的影响因子 稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 1) pH值： 蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。远离等电点的pH值，溶解度增加。 通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂。 2) 溶剂的极性和离子强度： 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。有些蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中有较大的溶解度， 如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。 通常，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂。 相似相溶 3)水解酶： 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。 加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。 加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用； 加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性； 加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力； 还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 4) 温度： 为防止变性和降解，制备