分子 第四章 dna、rna及蛋白质操作技术_生物学_自然科学_专业资料.ppt

Prepared and presented by Dengyue Yuan Molecular Biology 第四章 DNA、RNA及蛋白质操作技术 第一节 凝胶电泳技术 Molecular Biology ◇核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。 ◇核酸凝胶电泳的优点： （1）便于分离；（2）便于检测；（3）便于回收。 Abstract （1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移。 （2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数。 一、核酸凝胶电泳的基本原理 1、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 二、核酸凝胶电泳的类型 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨分辨范围为1~1000bp之间。 二、核酸凝胶电泳的类型 ①变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离与纯化。变性的DNA在凝胶中的迁移率几乎与碱基组成及序列完全无关。主要用途包括放射性DNA探针的分离、S1核酸酶消化产物的分析和DNA测序反应产物的分析。 ②非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。主要用途为制备高纯度的DNA片段和检测蛋白质-DNA复合物。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 凝胶类型及含量 分离DNA片段大小范围/bp 0.3%琼脂糖 50000-1000 0.7%琼脂糖 20000-1000 1.4%琼脂糖 6000-300 4%聚丙烯酰胺 1000-100 10%聚丙烯酰胺 500-25 20%聚丙烯酰胺 50-1 ◇凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 琼脂糖凝胶电泳 三、核酸凝胶电泳的操作步骤 称样 溶解 加样 三、核酸凝胶电泳的操作步骤 制板 倒胶 取样 琼脂糖凝胶电泳 三、核酸凝胶电泳的操作步骤 点样 电泳 检测 琼脂糖凝胶电泳 三、核酸凝胶电泳的操作步骤 SDS 凝胶制备（3h） 加电泳缓冲液 加胶条 电泳 10mA,30Min 30mA,6h 三、核酸凝胶电泳的操作步骤 SDS 负极 正极 浓缩胶 分离胶 （1）DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比。 （2）琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快。 （3）DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 四、DNA的迁移速率决定因素 （4）凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 （5）所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 （6）琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖。 四、DNA的迁移速率决定因素 ◇常用的电泳缓冲液有TAE和TBE。 （1）TAE：由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液。 （2）TBE：由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、硼酸(boric acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液。 五、电泳缓冲液 ◇TAE与TBE电泳缓冲液的比较： （1）TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量，且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 ◇TAE与TBE电泳缓冲液的比较： （2）TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 ◇ 通过染色, 紫外灯下检测。 （1）溴化乙锭(ethidium bromide，EB)：是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。 5、琼脂糖凝胶中DNA的检测 （1）银染色: 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。 六、琼脂糖凝胶中DNA的